Fachbeitrag

Multiplex-Partikel-Tests

für die Epstein-Barr-Virus-Diagnostik
Bild 3: Testauswertung eines SERION MultianalytTM-Epstein-Barr-Virus-IgG-Panels: Die unterschiedliche Fluoreszenz der Partikel (rote Emission) dient der Identifikation der mit einem bestimmten Antigen beladenen Partikel. Mittels der Fluoreszenz des Konjugates (grüne Emission) erfolgt die Quantifizierung der Antikörper.

Dr. Ulrich Leinfelder, Dr. Sabine Reder, Olaf Degen und Dr. Gerhard Hermann*)

  1. Institut VIRION/SERION GmbH, Marketing, 97076 Würzburg, E-Mail: dialog@virion-serion.de


Das Epstein-Barr-Virus (EBV) ist ein weltweit verbreitetes DNA-Virus, welches in Industrienationen meist bei Jugendlichen oder jungen Erwachsenen auftritt – in Entwicklungsländern hingegen oft schon bei Kindern. Oft wird übersehen, dass EBV-Infektionen nicht harmlos sind, sondern der Erreger zu den Gruppe-1-Karzinogenen gezählt wird. Für eine einfachere und schnellere Serodiagnostik hat die Institut Virion Serion GmbH neue Multiplex-Tests entwickelt und validiert, die auf allen gängigen Durchflusszytometern anwendbar sind. SERION MULTIANALYTTM-Tests basieren auf einer neuartigen Durchflusszytometer-Typ-unabhängigen Bead-Technologie, bei der verschiedene Antigen tragende Partikel nach Größe und Fluoreszenzintensität aufgetrennt werden können. Auf diese Weise lassen sich verschiedene Antikörper-Klassen in nur einer Probe kosteneffizient detektieren und quantifizieren.
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Das Epstein-Barr-Virus ist ein humanpathogenes DNA-Virus aus der Familie der Herpes-Viren. Es ist weltweit verbreitet und die Durchseuchungsrate ist sehr hoch. Bei Erwachsenen beträgt sie zwischen 90 und 95 %. In den Entwicklungsländern erfolgt die Primärinfektion in den ersten Lebensjahren und verläuft häufig subklinisch. Im Gegensatz dazu ist in den Industrieländern mit guten hygienischen Verhältnissen die Primärinfektion zeitlich verzögert und tritt häufig bei Jugendlichen und jungen Erwachsenen auf. Etwa 50 % der Infizierten entwickeln dabei das Krankheitsbild der Infektiösen Mononukleose aus. Die Übertragung erfolgt dabei meist über den Speichel infizierter Personen. Infektionen über Blutprodukte und Knochenmarktransplantate sind eher selten.

Das klinische Bild, immunologische Ereignisse und Infektionsverläufe können sich sehr komplex gestalten. In seltenen Fällen kann eine akute infektiöse Mononukleose in eine chronisch aktive Infektion übergehen. Genetisch bedingte Defekte (etwa x-linked lymphoproliferatives Syndrom, XLPS) können ebenso zu einem chronischen Krankheitsverlauf beitragen wie eine Herabsetzung der Immunkompetenz (beispielsweise bei AIDS-Patienten). Darüber hinaus ist für zahlreiche Tumorerkrankungen (Nasopharynx-Karzinom, Burkitt-Lymphom) eine Korrelation mit EBV bekannt.

Das SERION MultianalytTM-System

Für eine einfachere und schnellere Serodiagnostik hat die Institut Virion/Serion GmbH neue Multiplex-Tests entwickelt und validiert, die auf allen gängigen Durchflusszytometern anwendbar sind. Mit dem SERION MultianalytTM-System ist die Bestimmung mehrerer Parameter in einem Testansatz möglich. Dazu werden kodierte Partikel (Beads) mit den entsprechenden Antigenen beschichtet und in einem Multiplex-Testsystem, einem so genannten Plex, zusammengestellt. Die Plexe enthalten Partikel verschiedener Typen von ein, zwei oder mehreren Größen und Fluoreszenz-Intensitäten. Dadurch können Antikörper verschiedener Spezifitäten in einer Probe mittels der Durchflusszytometrie kosteneffizient detektiert und quantifiziert werden. Kurze Inkubationszeiten im Vergleich zu anderen Testsystemen, eine präzise Diagnose sowie eine anwenderfreundliche, schnelle und einfache Bewertung mit der SERION MultianalytTM-Software runden das System ab.

SERION MultianalytTM Epstein-Barr- Virus IgG und IgM

Die Antikörperantwort nach einer EBV-Infektion fällt aufgrund der Komplexität der Viren und der Variabilität der verschiedenen Infektionsphasen sehr heterogen aus. In der aktiven Phase der Primärinfektion werden Antikörper gegen ca. 100 verschiedene Antigene gebildet, in der Spätphase (Latenzphase) dann noch gegen ca. 10 Proteine (EBNA 1-6, Late Membrane Proteins 1-3). Vor diesem Hintergrund wurden in den letzten Jahren zunehmend Antikörpernachweise konzipiert, die nicht wie bisher mit dem Gesamtvirus-Antigen geführt werden, sondern einzelne Komponenten bzw. Proteine des Epstein-Barr-Virus verwenden. Somit ist es möglich, das Auftreten von Antikörpern gegen bestimmte Antigene des Epstein-Barr-Virus mit der Phase und Progression der EBV-Infektion zu korrelieren.

Mit SERION MultianalytTM Epstein-Barr-Virus IgG und IgM werden quantitative Tests für den Nachweis von humanen Anti-Epstein-Barr-Virus-Antikörpern in Serum oder Plasma gegen diese Antigene angeboten. Die EBV-VCA-Antigene p18 und p23 werden zur Bestimmung einer Primär- oder einer abgeschlossenen Infektion eingesetzt, wohingegen das EBV-EBNA1-Antigen p72 ausschließlich der Detektion von zurückliegenden Infektionen dient (siehe auch Bild 1). Die Fluoreszenz der unterschiedlich stark gefärbten Partikel und des Konjugates werden dabei genutzt, IgG- oder IgM-Antikörper nachzuweisen (Bilder 2 und 3).
Anti-VCA-IgM-Antikörper dienen dabei ausschließlich der Interpretation einer frischen Infektion. Sie treten meist zeitgleich mit Anti-VCA-IgG-Antikörpern auf – häufig auch verzögert. In seltenen Fällen fehlt dieser Marker, so dass ein negativer Befund eine „frische“ Infektion nicht ausschließt. In der Regel verschwinden IgM-Antikörper binnen weniger Wochen nach einer Primärinfektion wieder; in seltenen Fällen ist eine Persistenz über eine Zeitdauer von mehr als einem Jahr möglich. Anti-VCA-IgG-Antikörper dienen als Marker für eine zurückliegende Infektion und persistieren lebenslang.

Das Auftreten von Anti-EBNA1-IgG-Antikörpern schließt eine frühere Infektion sicher aus. In bis zu 10 % aller Fälle kann es dabei zu einem Verlust der sekundären Antikörper-Antwort aufgrund einer Störung der T-Zell-Immunantwort bei immunsupprimierten Patienten kommen, so etwa bei Patienten mit einer HIV- oder HBV-Infektion, nach einer Transplantation oder Patienten mit malignen Tumoren. Treten bei einer frischen Infektion Anti-VCA-IgM-Antikörper erst verspätet auf oder sind nicht mehr nachweisbar, so ist das Fehlen der Anti-EBNA1-IgG-Antikörper ein Hinweis auf eine frische Infektion.

Die Leistungsfähigkeit der SERION MultianalytTM Epstein-Barr-Virus IgG- und IgM-Tests wurde in internen Studien belegt. Die intraserielle Präzision der Antigen-gekoppelten Partikel wurde mit unterschiedlich reaktiven Seren im Mehrfachansatz (n = 20) innerhalb eines Testansatzes ermittelt. Für die Bestimmung der interseriellen Präzision wurden Serumproben mit unterschiedlicher Reaktivität in 10 unabhängig voneinander durchgeführten Ansätzen geprüft. Für beide Testsysteme lag der Variationskoeffizient für das Fluoreszenzsignal und die mittels Quantifizierung ermittelten Units/ml < 15 %, resultierend in einer hohen Homogenität der Daten. Die Sensitivität und Spezifität des IgG-Tests wurde im Vergleich zu einem Immunblot und beim IgM im Vergleich zu einem ELISA ermittelt. Für die Sensitivität des SERION MultianalytTM Epstein-Barr-Virus IgG wurden folgende Werte ermittelt: VCA-IgG 96,9 % (p18) und 98,6 % (p23) sowie 96,6 % für EBNA1-IgG (p72). Die Spezifitäten lagen in gleicher Reihenfolge bei 92,9 %, 100 % und 96,8 %. Es wurden insgesamt 100 Seren bewertet. Für den SERION MultianalytTM-Epstein-Barr-Virus IgM wurden für beide Parameter jeweils 100 % erreicht (80 Seren).
Durch den Nachweis beider Antikörperklassen ergab sich eine eindeutige Zuordnung aller Seren zu einer frischen oder zurückliegenden Infektion.

Fazit und Ausblick

Die bestehenden serologischen Testverfahren bieten in der Regel qualitative (Blot) oder quantitative Einzel-Nachweisverfahren (ELISA) an. Das SERION MultianalytTM-System ermöglicht den quantitativen und simultanen Nachweis von Antikörpern verschiedener Spezifitäten gegen bestimmte Antigenstrukturen des Epstein-Barr-Virus in einer Probe mittels der Durchflusszytometrie. Die Kombination verschiedener Partikelgrößen, Fluoreszenzintensitäten und von an diese Partikel gekoppelten Antigenen stellt somit ein neues und hocheffizientes Multiplex-System für den serologischen Nachweis dar. Eine Reihe von im Labor häufig verbreiteten Geräten verschiedener Hersteller können genutzt werden, wie das BD FACSCaliburTM-System, Beckman Coulter® Cytomics FC 500 und EPICS® XLTM, Partec CyFlow® und andere.

Die neuen SERION MultianalytTM-Tests eröffnen völlig neue Wege in der Diagnose, bei Verlaufskontrollen und der Patientenbetreuung. Neben den Epstein-Barr-Virus-Tests können auch andere serologische Fragestellungen mit dieser Methode geklärt werden. Die Institut Virion/Serion GmbH wird ihre Erfahrung in der Diagnostik von Infektionskrankheiten nutzen, um neue Multiplex-Systeme anzubieten zu können. Besonders bei aufwändigen Bestätigungstests (beispielsweise der Nachweis von Borrelia burgdorferi (Borreliose) oder Bordetella pertussis (Keuchhusten)) sind solche neuen Multiplex-Tests für den Labormediziner oder das Klinikum von Interesse. Weitere Diagnostik-Systeme für verschiedene Erreger sind denkbar. In naher Zukunft ist auch geplant, diesen Bereich zu automatisieren. Die in Bild 1 dargestellte Form der Mischung der unterschiedlichen Partikel ist keine zwingende Einteilung; das Interesse der Patienten steht im Vordergrund und individuelle Plexe für laborspezifische Anforderungen können in Zukunft zusammengestellt werden.

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