Markierungsfreie Hochdurchsatz-Analysen

Früh und schnell: Kandidatensuche in der Wirkstoffentwicklung

Mit der Einwellenreflektometrie (engl. „SCORE – Single Colour Reflectometry”) lassen sich in einer Messung hunderte bis mehrere tausend biomolekulare Interaktionen markierungsfrei hinsichtlich ihrer Wechselwirkungseigenschaften charakterisieren. Was somit früher meist nur der Charakterisierung von wenigen Leadstrukturen am Ende des Entwicklungsprozesses von pharmazeutischen Wirkstoffen vorbehalten war, kann nun im hohen Durchsatz bereits im Anfangsstadiums des Entwicklungsprozesses von Biologics eingesetzt werden.

Eine markierungsfreie µ-Array-Workstation für Untersuchungen biomolekularer Interationen. (Bild: Biametrics)

Neben dem Vorteil eines vereinfachten Messablaufs durch den Wegfall eines Markierungsreagenzes profitieren Anwender der SCORE-Technologie vor allem durch die Zeitersparnis bei der Bestimmung von Parametern wie Spezifität und Bindungsstärke. Auch weiterführende Charakterisierungen, wie die Aufklärung der Bindungsstrukturen (Epitope) sowie Assays zum Epitop-Binning profitieren durch diesen Ansatz.

Biomolekulare Wechselwirkungen
Auf molekularer Ebene lassen sich alle wesentlichen Vorgänge in einem lebenden Organismus auf die komplexen Wechselwirkungen vielfältiger Biomoleküle zurückführen. Das Wissen über dieses sogenannte Interaktom bildet somit die Basis für ein grundlegendes Verständnis z.B. der Vorgänge in einer Zelle oder der Kommunikation zwischen Zellen. Moderne pharmazeutische Wirkstoffe versuchen durch eine maßgeschneiderte spezifische Wechselwirkung mit einem oder wenigen Zielmolekülen gezielt in bestimmte Prozesse einzugreifen. Dabei müssen ungewollte Wechselwirkungen zwischen Pharmaka und anderen unbeteiligten Molekülen aus dem Interaktom möglichst ausgeschlossen werden.

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Hinsichtlich der reinen Funktionalität eines Wirkstoffs ist es zusätzlich notwendig auch die Bindungseigenschaften an die Zielstruktur – diese sind häufig bestimmte Rezeptoren, Kanäle oder Enzyme – entsprechend ihrer Aufgabe anzupassen. Für die Entwicklung z.B. eines therapeutischen Antikörpers bedeutet dies meist eine Suche nach Kandidaten, die sehr spezifisch und hochaffin bestimmte Epitope eines Zielmoleküls erkennen und binden.

Abbildung 1a: Ablaufschema eines Epitop Mapping Experiments. Die Antikörperkandidaten bzw. Fabfragmentkandidaten (Antikörper im Überschuss) werden sequenziell mit dem Antigen gemischt und vorinkubiert (links) Es bildet sich ein Antikörper-Antigen-Komplex (Mitte). Dieser Komplex kann nur noch an Antikörperspots auf dem Microarray binden, wenn das betreffende Epitop zugänglich ist (rechts, linker Spot).

Herausforderungen bei der Entwicklung therapeutischer Antikörper
Die Entwicklung therapeutischer Antikörper startet üblicherweise mit der Generierung einer Bibliothek an Zellkulturen, bei der jede Zelllinie einen monoklonalen Antikörper gegen das ausgewählte Zielmolekül produziert. Diese Antikörper unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Spezifität und Affinität zur Zielstruktur (Target) stark. Darüber hinaus werden von verschiedenen Antikörperkandidaten (Paratope) auch unterschiedliche Strukturen des Targets (Epitope) erkannt. In diesem frühen Screeningprozess der Biologics werden verschiedenste bioanalytische Methoden eingesetzt. Dabei werden die am besten geeigneten Kandidaten für weitere Entwicklungsschritte wie z.B. affinity maturation, humanization oder die Kombination zu bispezifischen Antikörpern (inkl. ihrer Produzierbarkeit in Zelllinien) ausfindig gemacht.

Eine häufige Herausforderung, neben dem Durchsatz der eingesetzten analytischen Methoden, ist die Identifikation der geeignetsten Kandidaten. Da die Zellkulturen die Antikörperkandidaten in unterschiedlichen Konzentrationen produzieren, kann dies immer wieder zu Fehlinterpretationen führen. Markierungsfreie Biosensortechnologien haben hierbei den Vorteil, dass sie direkt beim ersten Screening nicht nur eine Antwort geben, ob ein Antikörper bindet, sondern auch Hinweise auf die Affinität und die zugrundeliegenden Ratenkonstanten der biomolekularen Reaktion erlauben. Dies ermöglicht die sichere Identifikation von sehr guten Antikörperkandidaten, auch wenn diese nur in geringerer Konzentration vorliegen.

Bild 1c: Die Binning-Matrix fasst die Bindungsereignisse aus den sequentiell vermessenen Komplexen zusammen.

Markierungsfreie Microarrays
Die Microarraytechnologie ist seit vielen Jahren als Hochdurchsatzmethode etabliert. Dabei können tausende Biomoleküle auf einem Microarray immobilisiert (Spotting) und die Reaktion mit einem Bindungspartner durch fluoreszenzmarkierte Sekundärreagenzien ausgewertet werden. Jedoch erlaubt diese Technologie keine Rückschlüsse auf Affinitäten oder Ratenkonstanten. Erst durch die Kombination mit der SCORE-Messmethode ist es möglich, Interaktionen auf Microarrays markierungsfrei zu messen. Zusätzlich ermöglicht die zeitaufgelöste Beobachtung des Bindungsprozesses, bestehend aus der Assoziations- und Dissoziationsphase, die Bestimmung kinetischer und thermodynamischer Kenngrößen für alle Bindungspartner/Reaktionen auf dem Microarray.

Markierungsfreie Microarrays sind somit ein ideales Tool, um die beschriebenen Herausforderungen bei der Entwicklung von therapeutischen Antikörpern zu lösen. So lassen sich mit Hilfe von IgG-(Immunglobulin-G-)Fängeroberflächen und etablierten Microarraydruckverfahren effektiv alle Antikörperkandidaten eines Screeningansatzes direkt aus dem Zellkulturüberstand auf das Microarray bringen. Durch die markierungsfreie Detektion der Anbindung des Antigens an die jeweiligen Antikörperspots kann der Nutzer sehr leicht die besten Kandidaten identifizieren und hinsichtlich der jeweiligen Bindungscharakteristika einordnen.

Bild 2: Das Bild der SCORE-Messung am b-screen (links) zeigt die Binding des anti-Fab Antikörpers an die Peptidspots auf dem Microarray am Ende der Inkubationsphase. Im Vergleich hierzu ist die Bindung des gleichen Antikörpers an die Peptidsequenzen nach Fluoreszenzmarkierung und Messung am Fluoreszenzscanner gezeigt (rechts).

Im weiteren Entwicklungs- und Charakterisierungsverlauf sind durch angepasste Assay-formate auch Epitopmapping und Binning-Experimente möglich. Dabei ist heutzutage insbesondere die Aufklärung der von den Antikörpern gebundenen Epitope von großem Interesse. Solche Epitopkartierungen können aus den Binning-Experimenten abgeleitet werden oder durch den Einsatz von Peptidmicroarrays für lineare Epitope durchgeführt werden.

Beispielhaft zeigt Bild 1a, wie ein Epitop-Binning-Experiment von verschiedenen Antikörpern im Microarrayformat durchgeführt wird. Hierzu werden im ersten Schritt alle Antikörperkandidaten in Replikaten auf ein Microarray gedruckt. Nachfolgend wird für jeden Antikörper eine Messung durchgeführt, bei der der Antikörper im Überschuss zunächst mit dem Antigen inkubiert wird, bevor er als Probe über das Microarray geleitet wird. Beobachtet man die Bindung einer solchen Mischung an einen bestimmten Antikörper auf dem Microarray (Bild 1b), so kann man feststellen, dass die Paratope der beiden Antikörper sich sterisch nicht bei ihrer Bindung an die Epitope auf dem Antigen behindern. Aus diesen Experimenten wird die sogenannte Binning-Matrix (Bild 1c) abgeleitet, die die Grundlage für die abgeleitete Epitopkartierung darstellt (Bild 1d).

Bild 3 a: Korrespondierende Bindungskurven für jeden Peptidspot auf dem Microarray über die gesamte Messzeit mit dem anti-Flag Antikörper.

Die auf diesem Wege im Screeningprozess identifizierten Antikörper können nachfolgend auch mit weiteren markierungsfreien Microarrayexperimenten hinsichtlich ihrer Kreuzreaktivität zu ähnlichen Antigenen bzw. hinsichtlich eventueller Off-target-Bindungseigenschaften untersucht werden. Hierzu werden z.B. Proteinmicroarrays eingesetzt, die neben dem eigentlichen Antigen noch eine Vielzahl weiterer Proteine aus dem Interaktom präsentieren.

Neben komplexen Proteinen, wie den therapeutischen Antikörpern, besteht eine große Hoffnung, neue peptidbasierte Wirkstoffe zu identifizieren. Dabei ist die leichte synthetische Zugänglichkeit dieser Moleküle ein großer Vorteil bei der Bereitstellung verschiedenster Strukturen für eine Screeningkampagne.

Bild 3b: Exemplarisch sind die sechs Bindungskurven eines Spots auf dem Peptidmicroarray gezeigt, die für Messungen von sechs verschiedenen Antikörperkonzentrationen erhalten wurden. Diese Daten wurden für die Bestimmung der kinetischen Ratenkonstanten und der Bindungskonstante benutzt.

Im Bereich der Peptidmicroarrays wurden in den letzten Jahren große Fortschritte bei der Erzeugung von kundenspezifischen Bibliotheken gemacht. Neben dem klassischen Ansatz, offline synthetisierte Peptide auf Microarrays zu drucken, haben insbesondere On-chip-Synthesetechnologien Entwicklungen auf diesem Gebiet stark beschleunigt. In Kombination mit der markierungsfreien Detektion über SCORE ist es nun möglich, große Peptidbibliotheken hinsichtlich der besten Target-Binder zu durchsuchen bzw. gleichzeitig zu charakterisieren. Bild 2 zeigt das Bindemuster des anti-FLAG-Antikörpers der markierungsfreien SCORE-Auslesemethode im Vergleich zur klassischen fluoreszenzbasierten Auswertung auf einem aus 1485 Peptidspots bestehenden Peptidmicroarray. Durch die zeitaufgelöste Detektion ermöglichen die SCORE-Daten zusätzlich die Bestimmung von Kinetik und Thermodynamik aller biomolekularer Wechselwirkungen für jeden Spot (Bilder 3a und 3b). Eine Darstellung der so gewonnenen Daten als z.B. Affinity Heatmap (Bild 4) erlaubt es sehr einfach, die Peptidkandidaten mit den höchsten Affinitäten zum untersuchten Target zu bestimmen.

Bild 4: Die Affinitätskarte zeigt von blau nach rot aufsteigende Affinitätswerte für alle Peptidspots auf dem Microarray an.

Zusammenfassung
Markierungsfreie Microarrays werden das Screening bei der Entwicklung von Biologics wie therapeutischen Antikörpern qualitativ verbessern und beschleunigen. In Kombination mit Peptid- und Proteinmicroarrays leistet die SCORE-Technologie der Biametrics (s. Bild S. 12) einen wichtigen Beitrag bei der frühzeitigen und akkuraten Identifikation und Charakterisierung von Kandidaten in der Entwicklung von Biologics und Peptidpharmazeutika.

AUTOR
Dr. Günther Proll
Managing Director
Biametrics GmbH, Tübingen
E-Mail: guenther.proll@biametrics.com

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