Ursachen, Auswirkungen und Gegenstrategien

Matrixeffekte in der Gaschromatographie

Matrixeffekte sind nicht nur die Achillesferse in der LC-MS, auch die Gaschromatographie bleibt nicht von matrixbedingten Quantifizierungsstörungen verschont. Sowohl die Ursachen, als auch die Auswirkungen sind bei beiden Techniken aber grundverschieden. Oberflächenaktive Stellen und Ablagerungen unflüchtiger Probenbestandteile können in der GC das sog. „Matrix-Induced Response Enhancement“ auslösen und Ergebnisse verfälschen. Man kann Analyten aber davor schützen bzw. die unerwünschten Auswirkungen kompensieren. 

Obwohl sie in erster Linie in der aufstrebenden Zukunftstechnik LC-MS(/MS) als Hauptproblem bei der Quantifizierung gelten, sind Matrixeffekte in der Gaschromatographie nicht völlig unbekannt. Sie treten bei den klassischen GC-Applikationen nur nicht so dominant in Erscheinung bzw. lassen sich meist einfacher in den Griff bekommen.

Heiße Injektoren und Ablagerungen
Die Ursache für unerwünschtes Peak-Tailing und diverse Zerfallsphänomene mit den daraus resultierenden GC-Matrixeffekten sind praktisch immer aktive Stellen auf der Oberfläche. Mit Abstand am meisten betroffen sind der Liner bei verdampfenden Injektoren und der Anfang der Kapillarsäule, aber auch wenig inerte Trennsäulen und Transferleitungen (z.B. Open Split Interface als Eingang in das Massenspektrometer oder Verbindungsleitungen bei Säulenschaltungen etc.) können die Problematik verschlechtern.

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Meist nehmen die unerwünschten Effekte zu, je stärker das GC-System durch nicht flüchtige Verunreinigungen kontaminiert wird. Diese Ablagerungen können die Analyten absorbieren und/oder ihren (katalytischen) Zerfall bewirken.

Bild 1: Splitless-Injektor mit inertem Probenweg (silanisierte Glaswolle in Quarz-Liner und goldbeschichteter Injektorboden). © Agilent Technologies

Entscheidend für die Störungen sind der Umfang der Ablagerung und der Typ der aktiven Stellen, die sich im Injektor und am Säulenanfang bilden. Seitens der Analyten sind besonders jene besonders gefährdet, die thermolabil sind und zu Wasserstoffbrücken-Bindungen neigen. Die Konzentrationen der Zielanalyten spielt dabei eine besondere Rolle, da sich die Störeinflüsse im Spurenbereich besonders ausgeprägt zeigen.

Auf der Hardware-Seite sind die Injektortemperatur, die Inertheit aller Oberflächen mit Probenkontakt (Bild 1) und die Kontaktzeit der Analyten von besonderer Bedeutung. Je länger die Analyten mit den oberflächenaktiven Stellen in Interaktion treten können, desto wahrscheinlicher werden die Probleme. Diese Gefahr kann durch einen möglichst schnellen Transfer der Zielanalyten vom heißen Injektor in die Säule reduziert werden. Bei der Splitless-Probenaufgabe begünstigten Druckpuls-Injektionen (Pressure Pulse Injection), kleine Injektionsvolumen und Lösungsmittel mit geringem Dampfvolumen (kleine Molekularmasse; [1]) die erwünschte Reduktion der Kontaktzeiten. Sehr hilfreich sind dabei auch höhere Gasflussraten durch größere Säulendurchmesser und Wasserstoff oder Helium als Trägergas. Grundsätzlich sind Kaltaufgabe-Techniken wie PTV (Programmed Temperature Vaporizing) durch eine sanft beginnende temperaturprogrammierte Verdampfung oder überhaupt die Vermeidung der belastenden Verdampfung in einem heißen Injektor von Vorteil. Die sog. „Cool On-Column“-Injektortechnik (OCI) ist die schonendste aller Probenaufgabemethoden, da sie die Probenlösung unmittelbar als Flüssigkeit innerhalb der Säule appliziert.

Eine besondere Rolle spielt natürlich der Matrixtyp, d.h. die Art der unverdampfbaren Rückstände und insbesondere deren Konzentrationen. Maßnahmen zur Reduzierung der störenden Matrixbestandteile, wie aufwändige Reinigungsprozeduren (Clean up) sind oft schwierig und nicht immer möglich (unwirtschaftlich hoher Aufwand; unvermeidbare Analytverluste, etc.), und abgesehen davon nur zum Teil effektiv.

Bild 2: Schematische Darstellung der Ursachen für den „Matrix-Induced Response Enhancement“- Effekt im Splitless-Injektor und am Säulenanfang. Vergleich der Injektionen eines reinen Kalibrierstandards (oben) vs matrixbelastete Probe (unten).

Eine naheliegende Abhilfe bei der am häufigsten eingesetzten Splitless-Technik ist der regelmäßige Austausch der verunreinigten Liner (meist Quarz- oder Glasrohr, in dem die Verdampfung stattfindet) gegen saubere und möglichst gut deaktivierte Verdampferröhrchen, sowie das Abschneiden des Anfangsteils der Kapillarsäule (z.B. 10 cm bis eine Windung). Außerdem bauen alle nachfolgenden Probeninjektionen sukzessive wieder Ablagerungen auf. Die Verwendung silanisierter Glaswolle kann zwar den Transfer von Ablagerungen in die Kapillare verringern bis verhindern, trägt aber ihrerseits zur Vergrößerung der kritischen Kontaktfläche bei.

Matrix-Induced Response Enhancement
So lange der Weg der Analyten von der Injektion bis zum Detektor inert ist und auch bleibt, „überleben“ alle Analyten diese Strecke ohne Verluste, unabhängig davon, ob sie alleine (reine Standardlösungen) oder gemeinsam mit Probenbestandteilen „reisen“. Sobald sich jedoch oberflächenaktive Stellen im System aufbauen und die Zielanalyten darauf empfindlich sind, tritt folgendes Phänomen auf. Unter den in Proben immer (zu) reichlich vorhandenen Störstoffen sind auch viele polare Bestandteile, die durch ihre vergleichsweise hohe Konzentration oft alle oberflächenaktiven Stellen abdecken oder sättigen (Bild 2, unten). Die empfindlichen Zielanalyten können somit bei matrixbelasteten Proben, quasi im Schutz der Begleitstoffe, die gefährlichen Passagen überwinden, während sie bei reinen Kalibrierstandards ungehindert dem Kontakt mit den aktiven Stellen ausgesetzt sind und dann zum Teil irreversibel adsorbiert, absorbiert und/oder zersetzt werden (Bild 2, oben). Dieser Effekt ist unter dem Begriff „Matrix-Induced Response Enhancement“ bekannt (MIRE).

Die unerwünschte Reduktion von Zielanalyten bei der Injektion in reinem Lösungsmittel führt ausschließlich bei den Standards zur Abflachung der Kalibrierkurve. Probenlösungen bleiben von dieser Unterdrückung verschont und zeigen folglich überhöhte Resultate (Bild 3, rot). Während bei der LC-MS die Probenbestandteile hauptsächlich zur Ionenunterdrückung in der Ionenquelle beitragen und damit zu Minderbefunden bei den Ergebnissen führen, resultieren beim erläuterten GC-Problem vergleichsweise zu hohe Ergebnisse bei Probenlösungen.

Bild 3: „Matrix-Induced Response Enhancement“ in der GC vs Matrixeffekte in der LC-MS anhand schematisch dargestellter Kalibrierkurven.

Es soll nicht unerwähnt bleiben, dass auch der umgekehrte Fall bekannt ist, wenn auch deutlich seltener. Bei sehr empfindlichen, meist polaren Analyten kann es auch vorkommen, dass gerade in besonders reinen, d.h. erneuerten Linern (mit frischer Glaswolle etc.), die erwähnten Zersetzungsprozesse auftreten. Praktisch immer kommt es hier zu einem Peak-Tailing bei der Injektion von reinen Kalibrierstandards, jedoch zu normalen Peakformen bei Proben. Erst nach einigen matrixbelasteten Proben-Injektionen reduziert sich die Störung und auch die Peaks von reinen Standards werden symmetrisch. Als Erklärung darf angenommen werden, dass schon wenige freie Silanol-Gruppen des sauberen Systems für das Tailing ausreichen und die polaren Verunreinigungen der ersten Proben genügen, um diese zu maskieren. Dieser Effekt ist auch ein Indiz dafür, dass davon betroffene Analyten eigentlich nicht gut für die Gaschromatographie geeignet sind, da sie in einem sauberen, wenn auch nicht absolut inertem System, zu sehr zu Zerfall bzw. Absorption neigen.

Die Matrixeffekte in der Gaschromatographie dürfen nicht mit jenen in der LC-MS (wie in LABO 4-2017 beschrieben) verwechselt werden. Zur klaren Unterscheidung muss Folgendes beachtet werden:

Während GC-Matrixeffekte im heißen Injektor und am Säulenanfang stattfinden, treten sie in der LC-MS ausschließlich erst nach der Chromatographie in der Ionenquelle auf. Bei der GC wird das Probensignal praktisch immer deutlich verstärkt, während es in der LC-MS meist unterdrückt wird (Bild 3). Die Verbesserung der chromatographischen Auflösung ist in der Gaschromatographie völlig wirkungslos auf diese Effekte, während sie in der LC-MS hilfreich sein kann. Bei der LC-MS gibt es typischerweise keine Veränderungen des Matrixeffektes während einer Sequenz, in der Gaschromatographie ist das jedoch meist der Regelfall. Da die Kontamination der beteiligten Oberflächen mit jeder Probe zunimmt, zeigen Kalibrierstandards in der GC am Ende der Sequenz höhere Signale (steigender Response-Trend). Die im Folgenden beschriebenen Analyt-Protektoren sind aufgrund ihrer Funktionsweise nur in der Gaschromatographie hilfreich, und würden bei der Ionisation in der LC-MS eher zu noch größeren Suppressions-Effekten führen. Die Echo-Peak Strategie [2] ist in der LC-MS mit Einschränkungen wirksam, in der GC hingegen unbrauchbar.

Bild 4: Strukturen von typischen Analyt-Protektoren.

Kompensationsstrategien
Wenn man Matrixeffekte nicht effektiv verhindern oder auf ein vertretbares Maß reduzieren kann, führt der klassische Weg in Richtung Kompensation durch Standardaddition oder Matrix-Kalibrierung.

Bei der Methode der Standardaddition wird die Kalibrierfunktion nicht separat mit einer künstlich hergestellten Verdünnungsreihe aus externen Standards erstellt. Vielmehr wird die Probe erst alleine, und dann gemeinsam mit definierten Mengen der/des Analyten nochmals vermessen. Daher wird das Verfahren auch als Aufstockmethode bezeichnet. Durch gezielte Zugabe von z.B. ein bis zwei definierten, unterschiedlichen Analytmengen kann die quantitative Auswirkung von Matrixeffekten bei jeder Probe bestimmt und damit individuell kompensiert werden. Die Standardaddition ist selbst bei nur einfacher Aufstockung sehr arbeitsintensiv in der Routineanalytik. In Einzelfällen und bei nur wenigen Zielanalyten ist sie eine sehr gut geeignete und relativ kostengünstige Variante der individuellen Kompensation von Matrixeffekten. Für Multimethoden mit vielen Analyten und weiten Konzentrationsbereichen ist sie jedoch zu komplex in der Durchführung. Auch sollten die zu erwartenden Konzentrationen jedes Analyten ungefähr bekannt sein, da die Dotierungen im selben Bereich liegen müssen. Letztlich bedeutet die Standardaddition eine Vervielfachung der Analysendurchgänge bei jeder Probe.

Bei der Matrix-Kalibrierung (auch als „Matrix Matched Calibration“ bekannt) wird angestrebt, auch bei der Kalibrierung möglichst ähnliche Bedingungen zu schaffen, wie bei Realproben. Dazu müssen bei der Kalibrierung in gleicher Weise Matrixbestandteile beigefügt werden. D.h. die Standardlösungen werden mit Extrakten von Proben hergestellt, welche keine Zielanalyten enthalten dürfen (Blank-Matrix). Die Matrixeffekte der Probenbestandteile beeinflussen die Kalibrierstandards jedoch nur dann im exakt gleichen Ausmaß wie bei den Routineproben, wenn die Probenzusammensetzungen gut übereinstimmen und möglichst konstant bleiben. Daraus ergibt sich, dass dieses Kompensationsverfahren nur bei definierter und gleichbleibender Matrix einsetzbar ist und Matrix-Schwankungen zu Fehlquantifizierungen führen können. Außer-dem ist Voraussetzung, dass grundsätzlich Blank-Material für jeden Probentyp verfügbar sein muss. Bei umfangreichen Multimethoden in der Rückstandsanalytik kann die Suche nach geeigneten Blank-Materialien schon zur unüberwindbaren Hürde werden. Sind jedoch alle Voraussetzungen gegeben, ist die Matrix-Kalibrierung eine sehr effiziente und kostengünstige Kompensationsmethode.

Isotopenmarkierte interne Standards
Als ideale interne Standards (IStd) zeigen isotopenmarkierte Zielanalyten in Abhängigkeit vom Markierungsgrad und der Markierungsvariante mehr oder weniger identes Verhalten im Vergleich zu ihren nativen „Vorbildern“ (SIVA Stabilisotopenverdünnungsanalytik). Voll 13C-markierte IStd zeigen praktisch völlig gleiches Verhalten und sind damit z.B. den kostengünstigeren internen deuterierten Standards überlegen. Trotz des höheren sog. Isotopeneffekts sind aber auch alle Deuterium-gelabelten Standards gut bis sehr gut als interne Standards geeignet.

Besonders wenn für die GC-Messung eine Derivatisierung notwendig ist, muss dringend empfohlen werden, die gelabelten Standards schon vor diesem kritischen Schritt sowohl den Proben, als auch den Kalibrierstandards beizufügen. Nur so können letztlich eventuelle Einflüsse von Probenbestandteilen auch auf die Umsetzungseffizienz der Derivatisierung, Adsorptionsunterschiede an Gefäßoberflächen etc. entdeckt und kompensiert werden (quasi Matrixeffekte vor der Chromatographie). Im Idealfall sollten die IStd schon vor einem notwendigen Clean up zugesetzt werden, um auch diesen nicht immer ganz verlustfreien Reinigungsprozess optimal kontrollieren zu können. Meist sind isotopenmarkierte Standards nur für einen Teil der Zielanalyten von Multimethoden kommerziell erhältlich und ein Kostenfaktor. Bei entsprechender Verfügbarkeit von gelabelten Standards ist die SIVA die technische Ideallösung, erfordert allerdings auch eine Detektion mittels Massenspektrometrie.

Auch durch Matrix-Induced Response Enhancement verursachte Quantifizierungsprobleme werden grundsätzlich durch isotopenmarkierte Zielanalyten kompensiert, da sie im gleichen Maße wie die nativen Analyten von Adsorption und/oder Zersetzungsvorgängen betroffen sind.

Werden nun die ohnehin vorhandenen Signale der internen Standards zusätzlich nach der klassischen externen Standardmethode ausgewertet, so zeigen sie bei jeder Probe die individuellen Wiederfindungsraten (Rückgewinnungen) der gelabelten IStd an.

Bei der GC übliche Matrixeffekte ergeben durch die teilweise Zersetzung der Analyten bei der Kalibrierung und dem Wegfall dieses Effektes unter Matrixeinfluss, abhängig vom Analyten, Rückgewinnungen von über 100 % bei den Proben. Diese Wiederfindungsraten lassen wiederum direkt auf die Unterdrückung der Analyten in sauberen Lösungen und damit auf den Zustand des GC-Systems hinsichtlich Inertheit schließen. Im Normalfall ist damit das Problem durch die automatische Korrektur mittels interner Standards gelöst.

Wenn das Matrix-Induced Response Enhancement aber schon so dominant geworden ist, dass z.B. Wiederfindungen von mehreren hundert Prozent auftreten (d.h. nur noch ein Bruchteil der Analyten im Detektor ankommt), müssen Maßnahmen zur Linderung der MIRE gesetzt werden (Liner-Austausch etc.). Obwohl der interne Standard vieles ausgleichen kann, leidet bei extremen Differenzen die Zuverlässigkeit und insbesondere die Präzision zu sehr.

Analyt-Protektoren
Ein völlig anderer Ansatz zielt auf den Schutz der Analyten ab, indem man künstlich Substanzen zumischt, welche die maskierende Wirkung von Matrixkomponenten simulieren.

Diese sog. Analyt-Protektoren („Analyte Protectants“; APs) zeichnen sich durch multiple Hydroxy-Gruppen aus (Bild 4) und werden im Überschuss zugesetzt. Damit interagieren APs über Wasserstoffbrücken-Bindungen mit den aktiven Oberflächenstellen des GC-Systems. So werden die für die Zielsubstanzen gefährlichen Stellen abgedeckt. Analyt-Protektoren müssen dazu in Konzentrationen, die wesentlich höher sind als jene der Zielanalyten, sowohl den Probenextrakten als auch insbesondere den Kalibrierstandard-Lösungen zugesetzt werden. APs werden meist als Mischung eingesetzt, um einen größeren Siedebereich abzudecken und damit möglichst viele unterschiedliche Zielanalyten zu schützen. Für die Pestizidanalytik wurden schon 2003 von Anastassiades 93 verschiedene Komponenten auf ihre Eignung als APs getestet [3].

So kann es mit Analyt-Protektoren gelingen, einen höheren Schutzeffekt aufzubauen, als er von so manchen Matrixkomponenten bewirkt werden kann. Daher ist es für die Quantifizierung auch erforderlich, die APs nicht nur bei Standards, sondern auch bei Proben in gleicher Mischung und Konzentration einzusetzen.

Dieser Problemlösungsansatz ist einfach, schnell und kostengünstig. Vor allen Dingen ersetzt und erübrigt er die umständliche Matrix-Kalibrierung, ohne zusätzliche Ablagerungen durch Probenbestandteile schon bei der Kalibrierung zu generieren. Selbst die Austausch- und Reinigungsintervalle konnten bei GC-MS-Systemen für die Pestizidanalytik etwas verlängert werden, da auch mit verschmutzten GCs gute Resultate erzielt werden konnten. Sogar nach 1000 Injektionen am GC-MS musste die Ionenquelle des Quadrupol-Massenspektrometers noch nicht gereinigt werden [3].

Selektive Detektoren (GC-MS im SIM-Modus) vorausgesetzt, führen die meisten Analyt-Protektoren auch zu keinen störenden Interferenzen im Chromatogramm.

Fazit
Nach dem Motto „Was einzeln gut ist, muss in Kombination noch besser sein“, ist es naheliegend, die schützende Wirkung von Analyt-Protektoren mit der kompensierenden Funktion von isotopenmarkierten Standards zu kombinieren. Damit wird auch für schwierige Applikationen mit sensiblen Analyten eine nachhaltige und präzise Quantifizierung in der GC-MS (/MS) möglich.

Literatur
[1] W. Brodacz, „Lösungsmittelauswahl in der GC“; LaborPraxis, S14-19, September 1998.
[2] W. Brodacz, „Matrixeffekte in der LC/MS. Strategien zu ihrer Beherrschung – Teil-2: Kompensation”; LABO 04/12; S 40-43; April 2012.
[3] Michelangelo Anastassiades, Katerina Maštovská, Steven J. Lehotay, „Evaluation of analyte protectants to improve gas chromatographic analysis of pesticides“; Journal of Chromatography A, 1015 163–184; 2003.


Wolfgang Brodacz
AGES Österreichische Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit Lebensmittelsicherheit – Kontaminantenanalytik
E-Mail: wolfgang.brodacz@ages.at

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