Umgebungsbedingungen automatisiert erfasst und berücksichtigt

Normgerechtes Kalibrieren von Pipetten

Wegen teils veralteter oder abgekündigter Pipetten-Kalibrationsprogramme ist die normgerechte Kalibrierung von Pipetten nicht immer gegeben. Am Markt gibt es nur wenige Software-Lösungen, die den Ansprüchen und ISO-Vorgaben genügen und ein fachgerechtes Kalibrieren ermöglichen.

Viele Wissenschaftler arbeiten nach hohen Standards der modernen Biochemie oder Immunologie mit der Mikroliter-Pipette. Erfunden im Jahre 1957, machte sie es möglich, chemische und biologische Tests zu vereinfachen und mit sehr geringen Mengen an Flüssigkeit Tests durchzuführen und zu arbeiten. Das Aufnehmen der Flüssigkeit wurde, im Fall der offenen Pipette, früher durch Ansaugen mit dem Mund durchgeführt. Abhängig von der zu prüfenden Lösung war dies nicht nur eine Gefahr für die Gesundheit des Anwenders – es war auch sehr zeitaufwendig, besonders wenn viele Test-Lösungen abzuarbeiten waren.

Heute ist es schwer, sich ein modernes Labor ohne Mikroliter-Pipetten vorzustellen. Kein Wissenschaftler kann, sei es in biologischer oder chemischer Forschung, ohne Pipetten arbeiten. Denn sie ermöglichen, kleinste Mengen Flüssigkeit exakt zu dosieren, um Experimente mit großer Präzision durchzuführen. Allerdings kann diese Genauigkeit nur erreicht werden, wenn Pipetten und Dosiersysteme in regelmäßigen Abständen kalibriert werden, da sie sonst in einzelnen Fällen zu ungenauen Messergebnissen führen können.

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Um Fehlfunktionen rechtzeitig zu erkennen und die Richtigkeit sowie Präzision der Dosierwerkzeuge kontrollieren und auch dokumentieren zu können, wurden Software- und Hardware-Lösungen entwickelt, mit denen man sehr leicht im eigenen Labor arbeiten kann.

Bild 1: Automatisierte Erfassung der Umgebungsbedingungen durch das im Text beschriebene Klimamodul (PCOM-Box).

In den meisten Fällen werden Pipetten und Dosiersysteme zur Überprüfung an externe Dienstleister versendet. Bis zum Rückerhalt kann dann einige Zeit vergehen, in der die Liquid-Handling-Systeme nicht zur Verfügung stehen. Um hier Kosten und Zeit einzusparen, kann es gerade für Zwischenprüfungen, die außerhalb des üblichen Turnus liegen, sinnvoll sein, eine der am Markt befindlichen Software-Lösungen zur Kalibration von Pipetten anzuschaffen. Mit einer solchen Lösung können Anwender schnell und einfach Messungen vor Ort selbst durchführen. Allerdings sind hierbei einige Dinge zu beachten, auf die wir im Folgenden näher eingehen.

 Zwei Kalibrationsmethoden
Man unterscheidet heute zwischen zwei Methoden der Kalibrierung von Pipetten: die gravimetrische und die spektrometrische Methode. Beide haben ihre Vor- und Nachteile. Die gravimetrische Methode, bei der eine Testlösung mit der Pipette aufgenommen und dann auf speziellen Waagen gewogen wird, ist die am meisten verbreitete. Denn diese Methode ist einfacher und schneller durchzuführen als die spektrometrische Methode. Zudem ist die Anschaffung eines Spektrometers in der Regel mit hohen Kosten verbunden.

Allerdings können bei der gravimetrischen Methode Umweltfaktoren die Ergebnisse verfälschen. Temperatur, Feuchtigkeit und Atmosphärendruck beschleunigen oder verzögern die Verdunstung von Wasser, was zu Fehlern bei der Messung führen kann. Durch den sogenannten Z-Faktor können solche Einflüsse mit Hilfe einer mathematischen Formel kompensiert werden. Es ist absolut ratsam, bei einer gravimetrischen Methode eine geeignete Software-Lösung zu verwenden, die die Arbeit beim Kalibrieren entsprechend vereinfacht und die relevanten Umgebungsbedingungen automatisiert erfasst.

Bild 2: Unterschied zwischen Richtigkeit und Präzision – anschaulich erläutert an den Treffern auf einer Zielscheibe.

Richtigkeit und Präzision
Titration und Aliquotierung mit Pipetten und die Handhabung von Flüssigkeiten ist eine alltägliche Aufgabe für Forscher und Wissenschaftler, die im Bereich der Pharma-, Biotechnologie, Qualitätssicherung und der Herstellung von Lebensmitteln arbeiten.

Genauigkeit bedeutet, dass die Testlösung vom Gewicht genau dem pipettierten Volumen in der Pipette entspricht. Die Genauigkeit einer Pipette wird daher unter Verwendung von zwei Parametern gemessen: Richtigkeit und Präzision. Daraus ergibt sich, dass eine Messung nicht nur eine möglichst große Annäherung an das geforderte Ergebnis bringen muss (Richtigkeit), sondern die bei einer Mehrfachbestimmung ermittelten Werte dürfen auch nicht zu stark streuen (= Präzision). Bild 2 zeigt Treffer auf einer Zielscheibe und verdeutlicht damit auf einfache, aber anschauliche Weise den Unterschied zwischen Richtigkeit und Präzision.

Einhaltung von Standards
Neben der gängigen Norm für Kalibrierlabore DIN EN ISO 8655:2002 Teil 1-6 (Prüfung von Volumenmessgeräten) und der Richtlinie FDA 21 CFR Part 11 sind in akkreditieren Prüf- und Kalibrierlaboratorien die Standards DIN EN ISO/IEC 17025:2005 (Allgemeine Bedingungen) sowie die erweiterte Messun- sicherheit zu berücksichtigen und als Grundlage anzusehen.

Bild 4: So läuft die Kalibration mit der Kalibriersoftware Pipetto ab.

Die Deutsche Akkreditierungsstelle GmbH (DAkkS) ist die Rechtsnachfolgerin des DKD (Deutscher Kalibrierdienst). In diesem waren Prüf- und Kalibrierlaboratorien von Industrieunternehmen, Forschungsinstituten, technischen Behörden, Überwachungs- und Prüfinstitutionen zusammengeschlossen. Diese werden nun von der DAkkS akkreditiert und überwacht.

Kalibrierungen in akkreditierten Laboratorien erhöhen das Vertrauen der Kunden und geben Sicherheit für die Verlässlichkeit von Messergebnissen. Die Wettbewerbsfähigkeit für Unternehmen auf dem nationalen und internationalen Markt wird durch diese Qualitätssicherungsmaßnahmen verbessert.

Die erweiterte Messunsicherheit
Nach aktuellen DAkkS-Vorgaben gilt die Angabe eines Messergebnisses nur dann als vollständig, wenn sie neben den gemessenen Werten auch die mit der Messung verbundene Messunsicherheit enthält. In der EA (European cooperation for Accreditation) ist beschlossen worden, dass von den durch EA-Mitglieder akkreditierten Kalibrierlaboratorien eine erweiterte Messunsicherheit U in den Kalibrierscheinen anzugeben ist, die sich aus der Standardmessunsicherheit durch Multiplikation mit einem Erweiterungsfaktor k ergibt.

Bild 3: Pipette, Waage und ein PC mit installierter Pipetto-Software sind alles, was man für die Pipettenüberprüfung braucht.

Die Messunsicherheit grenzt den Wertebereich ein, innerhalb dessen eine tatsächliche Messung erfolgen wird. Durch Multiplikation mit dem Erweiterungsfaktor (für Deutschland k = 2) ergibt sich die erweiterte Messunsicherheit, in deren Werteintervall die Messgröße mit einer Wahrscheinlichkeit von 95 % liegen wird.

Zur Berechnung der erweiterten Messunsicherheit müssen alle die Kalibration beeinflussenden Größen im sogenannten Mess-unsicherheitsbudget herangezogen werden. Zu diesen zählen neben der eigentlichen Messunsicherheit der kalibrierten Pipetten unter anderem die Wiederholbarkeiten und Unsicherheiten der verwendeten Geräte wie Waage, Thermometer, Barometer – aber auch Abweichungen in den Laborbedingungen. Diese müssen mit ihrem jeweiligen Sensitivitätskoeffizient in das Messunsicherheitsbudget eingerechnet werden.

Kalibriersoftware für Pipetten und Dosiersysteme
Viele auf dem Markt befindlichen Software-Lösungen werden nicht mehr weiterentwickelt oder gepflegt. Nach derzeitigem Kenntnisstand ist die Software Pipetto der Firma IT-PEAK-Networks GmbH eine der wenigen Lösungen, die auch die neuesten Anforderungen aus den verschiedenen Normen abdeckt und skalierbar vom Einzelplatz bis zum akkreditierten Labor eingesetzt werden kann.

Um den aktuellen Normen und Spezifikationen gerecht zu werden, wird die Software mit einem zugehörigen PCOM-Modul zur automatischen Erfassung der aktuellen Umgebungsbedingungen ausgeliefert. Die Software wird bereits in DAkkS-akkreditierten Laboratorien eingesetzt.

Mit der Software können dank Anbindung der gängigen Mehrkanalwaagen sowohl Ein- als auch Mehrkanalpipetten schnell und sicher gemessen werden. Dies erfordert lediglich ein PC-System mit einem Microsoft-Betriebssystem, auf dem die Software installiert ist, und die mitgelieferte PCOM-Box (PEAK Klima Online Monitor), die an den Computer per USB angeschlossen wird.

Kalibrationsassistent vereinfacht Bedienung
Durch den Kalibrationsassistenten wird man schnell durch die für eine Kalibration erforderlichen Schritte geführt und kann nach Anlage der Kunden- und Pipettendaten sofort mit der Messung starten. Beim Messvorgang wird eine gewisse Menge Flüssigkeit in ein Gefäß pipettiert, deren Gewicht dann von einer an den PC angeschlossenen Präzisionswaage ermittelt wird. Während der Messung erfasst die Software Pipetto die Daten aus der PCOM-Box und berechnet anhand dieser den aktuellen Z-Faktor, der zum Umrechnen des gemessenen Gewichts in das entsprechende Volumen verwendet wird.

Um eine statistische Auswertung durchführen und Bedienungsfehler ausschließen zu können, wird diese Messung mehrmals wiederholt. Die gemessenen Werte und die Berechnungen werden in einem Mess- und Kalibrier-Bericht angezeigt und in einer Datenbank gespeichert, aus der dieser jederzeit ausgedruckt werden kann. Die Software ist sowohl als Einzelplatz-Version als auch im Client-Server-Betrieb einsetzbar.

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