Lebendzell-Imaging mit Interaktion

Dreidimensionale Zellverfolgung in komplexen Zellkulturträgern

Um Primärzellen und andere nicht-markierte Zellen in 3D-Umgebungen mit optisch anspruchsvollen Strukturen über lange Zeiträume in ihrem Verhalten zu verfolgen, sind relativ einfache mikroskopische Aufnahmetechniken in Verbindung mit effizienten automatisierten Bildanalysealgorithmen geeignet.

Bild 1: Ergebnis der Zellerkennung und -verfolgung von rund 80 Zellen (MDA-MB-231 Brustkrebszelllinie) über 330 Zeitschritte zu je 10 min in einem Volumen von 888 μm x 667 μm x 300 μm.

Zellexperimente in dreidimensionalen biomimetischen Mikroumgebungen im Labor bieten eine gute Möglichkeit, das Verhalten von Zellen unter relativ natürlichen Bedingungen zu simulieren und eingehend mikroskopisch zu untersuchen. Dadurch können ohne aufwändige Tierversuche kontrolliert Parameter der Zellkultur variiert und hohe Informationstiefen erreicht werden. Hierbei sind insbesondere die Interaktionen zwischen mehreren Zellen, sowie die Interaktion mit der umgebenden Matrix von Interesse, um u.a. Prozesse der Zellmigration, -teilung und -differenzierung bei biomedizinischen Fragestellungen wie Wundheilung und Tumorausbreitung besser zu verstehen. Wünschenswert sind ausgedehnte Experimentlaufzeiten von mehreren Stunden bis hin zu Tagen, um auch langfristige Verhaltensmuster erkennen zu können. Dabei sind die folgenden Herausforderungen und Randbedingungen zu beachten:

  • Möchte man möglichst hochqualitative mikroskopische Bilder, bei denen jedoch auf Grund von Färbe- oder Beleuchtungstechniken die Zellaktivität beeinträchtigt wird? Oder gibt man sich mit einfacherem Bildmaterial zufrieden, welches dagegen ein natürlicheres Zellverhalten ermöglicht?
  • Können Mikroskopiedaten (zellschonend) so erzeugt werden, dass sie visuell auffällig erscheinen und leicht von einem Computer-algorithmus bearbeitet werden können, um automatisiert eine hohe Anzahl analysieren zu können? Oder muss die Auswertung der Zellen manuell in tagelanger Arbeit an einer begrenzten Anzahl von Zellen durchgeführt werden?
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Im Folgenden wird die Nutzung von relativ einfachen mikroskopischen Aufnahmetechniken in Verbindung mit effizienten automatisierten Bildanalysealgorithmen beschrieben, mit denen Primärzellen und andere nicht-markierte Zellen in dreidimensionalen Umgebungen mit optisch anspruchsvollen Strukturen (optisch streuende fibrilläre Netzwerke) über lange Zeiträume in ihrem Verhalten verfolgt werden können.

Bild 2: 3D-Track sowie Geschwindigkeit und Morphologie (Rundheit, Aspektverhältnis) einzelner Makrophagen über einen Zeitraum von 68 Stunden; s.a. weiterführende Information in [4].

Biomimetische Zellkulturbedingungen und mikroskopische Aufnahmesituation
Eine gute Grundlage für mehrtägige Experimente wird durch den Einsatz von dreidimensio-nalen Kollagennetzwerken und verschiedenen biochemischen Funktionalisierungsoptionen geschaffen. So entsteht eine biomimetische Zellkulturumgebung, die variable und über mehrere Tage stabile Versuchsbedingungen erlaubt und gleichzeitig verschiedene In-vivo-Situationen gut nachbildet. Unterschiedliche Ausführungen dieser Zellkulturträger wurden in Arbeiten zum Zellverhalten während der dermalen Wundheilung [1], der Ausbreitung von Melanom- und Brustkrebszellen [2] sowie der Migration von Blutstammzellen [3] erfolgreich eingesetzt.

Die Bildgebung erfolgt dabei mittels einfacher Hellfeldmikroskopie, um das Problem der Abbildung der stark streuenden fibrillären Strukturen der dreidimensionalen Kollagennetzwerke zu vermeiden, wie sie sich z.B. bei der Phasenkontrastmikroskopie ergeben würden. Zudem wird der Einsatz kostenintensiver Verfahren wie konfokaler Laserscanning-Mikroskopie umgangen, um zudem zellschädigende Färbemethoden zu vermeiden und den Einsatz von Primärzellen aus Spendermaterial zu ermöglichen.

Zur Analyse der Zellkulturen werden nun dreidimensionale Bildstapel mit einem weiten Abstand in vertikaler Richtung, z.B. 5 µm, zu jedem Beobachtungszeitpunkt aufgenommen, so dass mit minimaler phototoxischer Beeinflussung zelluläre Prozesse über mehrere Tage untersucht werden können. Damit können Zellkulturvolumina von 1 x 1 x 0,5 mm über Zeiträume von einer Woche charakterisiert werden.

Automatisierte Bildanalyse und Zellverfolgung
Es lässt sich leicht erkennen, dass es sich bei der Detektion von Zellen in den großen Zellkulturvolumina und über die großen Zeiträume um eine zeitaufwändige Angelegenheit handelt: Typischerweise spricht man von mehreren hundert Zellen im Volumen und mehreren hundert Zeitschritten, wobei jeder Zeitschritt wiederum aus rund 100 Höhenschichten besteht. Dies ergibt Speichervolumen von 10 bis 100 Gigabyte und würde bei manueller Bearbeitung mehrere Tage in Anspruch nehmen.

Gleichzeitig ist auf Grund der Aufnahmebedingungen (Hellfeldmikroskopie) der Helligkeitskontrast in den Bilddaten relativ gering, so dass die exakte Höhenposition der Zellen nicht unmittelbar erkennbar ist. Das Problem liegt in dem dreidimensionalen Intensitätsbild, in welchem die Zelle durch den einfachen Mikroskopaufbau und die erschwinglichen Objektive geringer Vergrößerung und Apertur (z.B. 10 x, NA = 0.3) zur Untersuchung großer Volumina Ausdehnungen bis zu 100 µm in vertikaler Richtung besitzt. Dies bedeutet, dass Zellen über 20 bis 40 Höhenschichten (100–200 µm) in den Bildstapeln zu sehen sind, obwohl ihre physische Spanne nur wenige Mikrometer umfasst. Obwohl auf den ersten Blick dieser Umstand erschwerend ist, kann jedoch die physikalische Charakteristik der Intensitätsverteilung einer Zelle genutzt werden, um die exakte Höhenposition zu bestimmen. Da die Intensitätsänderungen in vertikaler Richtung primär durch Beleuchtungsverhältnisse des Mikroskopaufbaus (Beleuchtungsapertur, Objektivapertur) definiert werden, kann eine Suchfunktion mit genau diesen Parametern in einem Computer-algorithmus angelernt werden.

Vorgehen im entwickelten Detektionsalgorithmus
Bevor die automatische Detektion gestartet werden kann, werden dem Algorithmus zwei wesentliche Dinge mitgeteilt: Wie sehen eine Zelle und wie der Hintergrund aus? Dafür wird vom Anwender jeweils eine entsprechende Referenzposition in den Daten ausgesucht. Von dem gewählten Punkt ausgehend, wird der Intensitätsverlauf entlang der z-Achse betrachtet und gespeichert. Dadurch kann der Algorithmus erfassen, in wie vielen Höhenschichten und mit welchem Intensitätsverlauf eine Zelle sichtbar ist und wie stark die Unterschiede im Vergleich mit der Hintergrundintensität sind. Es ist anzumerken, dass vorerst ausschließlich die Intensität entlang der z-Achse betrachtet wird, jedoch nicht die Fläche der Zelle innerhalb der x-y-Ebene, also eines einzelnen zweidimensionalen Mikroskopbildes. Somit ist das Verfahren prinzipiell in der Lage, Zellen weitestgehend unabhängig von ihrer Morphologie zu erkennen.

Mit diesen beiden Informationen kann der gesamte Bildstapel abgesucht werden. Jede Bildposition wird sowohl mit der manuell definierten Zellvorlage als auch mit der Hintergrundvorlage verglichen. Je nachdem, zu welcher der beiden Vorlagen eine höhere Korrelation vorliegt, entscheidet der Algorithmus über die gegenwärtig betrachtete Position. Weitere Parameter, wie z.B. manuell gesetzte Bevorzugung einer der beiden Referenzen oder Entrauschung, beeinflussen das Ergebnis im Detail. Das Resultat dieses Schritts ist eine binäre 3D-Karte, welche das Mikroskopbild mit Markierungen für das vermutete Vorliegen einer Zelle und für Hintergrund versieht.

Im nächsten Schritt werden zusammenhängende und als Zelle markierte Subvolumina extrahiert. Diese überschätzen in der Regel deutlich die Ausdehnung entlang der z-Achse, und die Zelle erscheint sehr ausgedehnt in vertikaler Richtung. Das liegt an der oben erklärten Problematik, dass die Zellen nicht nur in ihrer eigentlichen Schicht abgebildet sind, sondern auch Intensitätsänderungen in 20 bis 40 umliegenden Schichten auftreten. Dieses Problem kann in einem weiteren Schritt angegangen werden: Die wahre Zellhöhe wird durch Vergleiche mit dem Referenzprofil abgeschätzt, und eine Genauigkeit kann erreicht werden, die mit ca. 1 µm deutlich besser ist als die optische Auflösung entlang der z-Achse und damit auch in den Bereich der Auflösung in der x-y-Ebene gelangt.

Abschließend können die detektierten Zellen aller Zeitschritte einander zugeordnet werden. Dafür gibt es verschiedene Verfahren. Ein leicht umzusetzendes Verfahren ist das Nearest-Neighbor-Tracking, welches jeweils annimmt, dass es sich bei den zwei nächstgelegenen Zellen aus zwei Zeitschritten um ein und dieselbe Zelle handeln muss. Dies funktioniert gut, insofern die Menge an Zellen überschaubar ist und die zurückgelegte Distanz einer Zelle zwischen zwei Zeitschritten relativ klein ist. Bekannte alternative Verfahren lassen sich hier auch implementieren, sind jedoch unabhängig vom neuentwickelten Mikroskopie- und Zelldetektionsansatz.

Die Zellerkennung in einem Datensatz von Brustkrebszellen mit 330 Zeitschritten, 75 Höhenaufnahmen pro Zeitschritt und rund 80 Zellen im Betrachtungsfenster benötigt auf einem herkömmlichen Computer (Intel i7-6700 CPU und 32 Gigabyte RAM) eine Rechenzeit von knapp 7 h. Das unkorrigierte Ergebnis ist als 3D-Ansicht in Bild 1 zu sehen.

Limitierungen
Wesentliche Grenzen der automatischen Detektion sind auf zu dicht besiedelte Zellkulturvolumina zurückzuführen. Wenn sich zwei Zellen fast berühren, kann es dazu führen, dass das Verfahren diese zusammenhängend als eine einzige Zelle erkennt. Der Grund liegt darin, dass keine Informationen über Zellränder gesammelt werden, sondern ausschließlich der genannte charakteristische Intensitätsverlauf entlang der z-Achse für die Zellsuche verwendet wird. Besonders problematisch sind benachbarte Zellen entlang der z-Achse, also überlappende Zellen. Da eine Zelle auf Grund des Aufnahmeverfahrens über 20 bis 40 Bildebenen sichtbar ist, kann jegliche andere Zelle in dieser Spanne das Resultat negativ beeinflussen und dazu führen, dass auch hier zwei oder mehr Zellen als ein großes Objekt erkannt werden.

In vielen praktischen Anwendungen kann mit dem hier vorgestellten Verfahren ein Großteil der Zellerkennung automatisiert durchgeführt werden. Der Grad der manuellen Intervention hängt natürlich stark von der Qualität der Daten ab – wobei in jedem Fall zunächst die Konfiguration des Algorithmus manuell vorgenommen werden muss. Dies umfasst die beschriebenen Parameter und die Auswahl der zwei Referenzpunkte. Anschließend, nach rund 5 min Rechenzeit pro aufgenommenem Zeitschritt, ist in der Regel eine manuelle Korrektur durch den Nutzer notwendig, bei der Fehler der Erkennung bearbeitet werden. Bei gut auswertbaren Daten beschränkt sich die Nacharbeit auf das Trennen einiger zu dicht positionierter Zellen, die zusammenhängend erkannt werden. Weiterhin kann es beim Nearest-Neighbor-Tracking auch zu Verwechslungen kommen, so dass insbesondere schnell migrierende Zellen mit Nachbarzellen vertauscht werden.

Anwendung der Zellverfolgung
Das Ergebnis der mikroskopischen Untersuchungen und automatisierten Bildanalyse ist eine Liste von Zellen für jeden Zeitschritt, die die Position einer jeden Zelle sowie weitere Informationen zur Morphologie enthält (Größe, Ausrichtung und Formfaktoren). Weiterhin kann auf Basis dieser Daten das zeitliche Verhalten der Zellen hinsichtlich der Morphologieparameter, aber auch die Migrationscharakteristik wie Geschwindigkeit, Gerichtetheit und Zufälligkeit der Bewegung, untersucht werden (s. ein Beispiel für Makrophagen in Bild 2). Zudem können natürlich auch Ereignisse wie Zellteilung und Zelltod detektiert werden.

Auf Basis solcher Analysen können nun bio-medizinische Fragestellungen unter Nutzung von unmarkierten Zellen sowie Primärzellen, über lange Zeiträume von Tagen angegangen werden. So lassen sich Migration, Prolifera-tion und Differenzierung in Abhängigkeit von komplexen biomimetischen Zellkulturbedingungen auch in Cokulturansätzen verschiedener Zelltypen charakterisieren. Die Anwendungen reichen in vielfältige biomedizinische Fragestellungen hinein, wie in die Bereiche Wundheilung, Stammzelldifferenzierung, aber auch Krebsentstehung und –ausbreitung, wo biomimetische Bedingungen der Zellkulturumgebung (Zusammensetzung, Mechanik, Mikrostruktur) und der Einsatz von Primärzellen in hochaufgelösten In-vitro-Experimenten notwendig sind, um den physiologischen Kontext möglichst gut nachzuahmen. Hierfür bietet der neue Algorithmus einen sehr preiswerten und effizienten Ansatz, unmarkierte Zellkulturen über große Zeiträume und große Volumina biomimetischer Zellkulturträger mit geringen phototoxischen Einflüssen zu untersuchen. Weitergehende Informationen zu dem Verfahren findet man in der kürzlich erschienen wissenschaftlichen Open-Access-Veröffentlichung in der Zeitschrift Scientific Reports [4].

AUTOREN
Johannes Waschke
Jiranuwat Sapudom
Tilo Pompe
Institut für Biochemie, Universität Leipzig

Referenzen
[1] Sapudom J, Rubner S, Martin S, Thoenes S, Anderegg U, Pompe T. The interplay of fibronectin functionalization and TGF-beta1 presence on fibroblast proliferation, differentiation and migration in 3D matrices. Biomaterials Science 3:1291-301 (2015).; Ansorge M, Sapudom J, Chkolnikov M, Wilde M, Anderegg U, Moller S, Schnabelrauch M, Pompe T. Mimicking Paracrine TGFbeta1 Signals during Myofibroblast Differentiation in 3D Collagen Networks. Scientific Reports 7:5664 (2017).
[2] Sapudom J, Rubner S, Martin S, Kurth T, Riedel S, Mierke CT, Pompe T. The phenotype of cancer cell invasion controlled by fibril diameter and pore size of 3D collagen networks. Biomaterials 52:367-75 (2015).; Sapudom J, Rubner S, Martin S, Pompe T. Mimicking Tissue Boundaries by Sharp Multiparameter Matrix Interfaces. Advanced Healthcare Materials 5:1861-7 (2016).; Sapudom J, Ullm F, Martin S, Kalbitzer L, Naab J, Moller S, Schnabelrauch M, Anderegg U, Schmidt S, Pompe T. Molecular weight specific impact of soluble and immobilized hyaluronan on CD44 expressing melanoma cells in 3D collagen matrices. Acta Biomaterialia 50:259-70 (2017).
[3] Ansorge M, Rastig N, Steinborn R, Konig T, Baumann L, Moller S, Schnabelrauch M, Cross M, Werner C, Beck-Sickinger AG, Pompe T. Short-range cytokine gradients to mimic paracrine cell interactions in vitro. Journal of Controlled Release 224:59-68 (2016).
[4] Sapudom J, Waschke J, Franke K, Hlawitschka M, Pompe T. Quantitative label-free single cell tracking in 3D biomimetic matrices. Scientific Reports, 7:14135 (2017).

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