Spektroskopie

Der schnelle Weg zur massenspektrometrischen Analyse

Volker Kruft*) und Nils Helge Schebb**)

Die Flüssigkeitschromatographie-Elektrospray-Massenspektrometrie (LC-ESI-MS) mit vorgeschalteter On­line-Festphasenextraktion (Online-SPE) reduziert den Vorbereitungsaufwand bei der Quantifizierung aus komplexen biologischen Proben.

Für die sensitive und spezifische Quan­tifizierung von Chemikalien und phar­mazeutischen Wirkstoffen ist die Flüssig­keitschromatographie, gekoppelt mit der Massenspektrometrie (LC-MS), die Me­thode der Wahl. Ein Nadelöhr - besonders bei der Analyse komplexer Proben wie Blut oder Urin - bilden dabei die zahl­reichen manuellen Probenvorbereitungs­schritte, die üblicherweise "offline" (d.h. in separaten manuellen Arbeitsschritten) durchgeführt werden, bevor die Proben in­strumentell analysiert und die Daten Soft­ware-gestützt ausgewertet werden können. Um auch mit komplexen Proben schnel­ler zu einem genauen und zuverlässigen Analyseergebnis zu gelangen, entwickelte Dr. Nils Helge Schebb vom Institut für Le­bensmitteltoxikologie und Chemische Analytik der Tierärztlichen Hochschule Hannover eine Methode, die den manu­ellen Probenvorbereitungsaufwand auf ein Minimum reduziert. Diese basiert auf klas­sischer LC-ESI-MS, der eine Festphasenex­traktion (SPE) online vorgeschaltet ist. Für die Arbeiten zur Untersuchung der humanen Exposition und biologischen Wir­kung des antibakteriellen Wirkstoffs Triclo­carban wurde Dr. Schebb mit einem auf 3000 Euro dotierten Award der Firma AB SCIEX ausgezeichnet. Der Nachwuchswissen­schaftler erhielt den Preis auf dem 9. LC-MS-Diskussionstreffen der Deutschen Gesell­schaft für Massenspektrometrie (DGMS e.V.) am 17./18. September 2012 in Wuppertal.

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Methodenentwicklung und -evaluierung

Im ersten Schritt der Online-SPE-LC-MS-Methode wird die Probe mit hoher Flussrate auf eine Umkehrphasen-Extrak­tionssäule engen Durchmessers gepumpt (Partikeldurchmesser: 50 µm). Hierbei wer­den die Analyten zurückgehalten, während störende Matrixbestandteile, vor allem Salze und Proteine, abgetrennt werden. Die Extraktion über Online-SPE dauert nur wenige Sekunden. Ein 6-Wege-Ventil sorgt dafür, dass die Analyten anschließend in umgekehrter Richtung wieder eluiert und im sogenannten "Backflush-Modus" direkt auf die Trennsäule transportiert werden (Bild 1). Dafür wird ein C18-Reversed-Pha­se-Material mit nicht vollständig porösen (solid core/fused core) Partikeln geringer Größe ( 2 µm) eingesetzt.
Es ist insbeson­dere die Kombination der großen Partikel der SPE-Säule, betrieben bei hoher Flussra­te, die mit modernen Hochleistungstrenn­säulen zu einer außerordentlichen Trenn­leistung des Systems führt. Die anschließende sensitive und spezi­fische Detektion erfolgt auf einem hoch­empfindlichen Triple-Quadrupol-Mas­senspektrometer im Selected Reaction Monitoring-(SRM-)Modus. Die Methoden zeichnen sich nicht nur durch eine hohe Geschwindigkeit mit einer Analysezeit von 2 min und weniger aus. Vielmehr weisen sie unter anderem durch den hohen Auto­matisierungsgrad eine große Präzision und Genauigkeitbei der Quantifizierung in bio­logischen Proben auf.

Einsatz in pharmakokinetischen Untersuchungen

Die Entwicklung von pharmakologischen Wirkstoffen erfordert die kontinuierliche Konzentrationsmessung der Testsubstanz im Organismus. Nur die Korrelation dieser Daten mit biologischen Effekten (bzw. to­xikologischen Endpunkten) ermöglicht ein Verständnis der Wirkung der Testsubstanz. Im Rahmen der Entwicklung neuer schmerz­lindernder Wirkstoff(kombinationen) ent­wickelten Schebb und Kollegen eine Me­thode zur Untersuchung von Inhibitoren der löslichen Epoxidhydrolase (sEHi) sowie Hemmern des Enzyms Cyclooxygenase, z.B. Diclofenac und Rofecoxib (VIOX). Neben der Geschwindigkeit, welche die Untersu­chung von mehr als 400 Proben pro Tag ermöglicht, ist der geringe Probenbedarf eine besondere Stärke der Methode. Nur 10 µl Vollblut sind zur Analyse notwendig, was auch die sequenzielle Blutentnahme im kleinen Nager erlaubt. Auf eine Probenvor­bereitung kann aufgrund des Online-SPE-Schrittes weitgehend verzichtet werden: Das Blut wird nach Mischen mit Wasser und internem Standard direkt injiziert. Ma­nuelles Abtrennen von Plasma oder Serum oder Aufbringen auf Papier und Herauslö­sen der Analyten (Dried Blood Spot Analy­sis) sind nicht erforderlich [1].

Die Methode zeigte eine außerge­wöhnliche chromatographische Auflösung. Durch Kombination von biologischen Daten mit den Analysenergebnissen war es möglich, in vivo eine Dosis-Wirkungs-Beziehung der analgetischen Wirkung von Inhibitoren der löslichen Epoxidhydrolase zu ermitteln (Bild 2), [1, 2].

Untersuchung der Triclocarban-Exposition

Die Online-SPE-LC-MS kann für zahlreiche unterschiedliche Anwendungen genutzt werden. So untersuchten Schebb und sei­ne Kollegen damit die Humanexposition durch Triclocarban (TCC) beim Duschen mit antibakterieller Seife. Diese enthielt TCC als antibakterielle Substanz, welches Kosmetika, die wieder abgewaschen wer­den, in Konzentration von bis zu 1,5 % zu­gesetzt werden darf. Verschiedene Studien deuten darauf hin, dass TCC sich in der Umwelt anreichert, was Fragen über die humane Exposition aufwirft [3].

Für den Versuch duschten sechs Pro­banden mit einer Seife, die TCC als anti­bakteriellen Wirkstoff enthielt. Anschlie­ßend wurden Urinproben gesammelt und die TCC-Konzentration sowie der Anteil der wichtigsten TCC-Metaboliten darin be­stimmt. Die massenspektrometrische Ana­lyse der Proben ergab, dass die Probanden durchschnittlich etwa 0,6 % des mit der Seife verwendeten TCC absorbierten. 10 bis 18 h nach einer einzigen Verwendung wurden maximale Konzentrationen an TCC und Metaboliten von bis zu 1 µM im Urin erreicht. Die Konzentrationen im Urin va­riierten allerdings deutlich innerhalb der Probanden ( Bild 3).

Trotz der belegten Aufnahme im menschlichen Körper lassen diese Expo­sitionsdaten keine Beurteilung zu, ob TCC die Gesundheit beeinträchtigen kann oder nicht. Um mögliche Wirkungen von TCC auf dem Menschen zu erfassen, analysier­ten die Wissenschaftler den hemmenden Effekt der Substanz auf sechs wichtige Enzymfamilien des Menschen in vitro. Es stellte sich heraus, dass der Seifenzusatz ein potenter Hemmstoff der löslichen Epoxid­hydrolase (sEH) ist.

Charakterisierung von Enzyminhibitoren

Die lösliche Epoxidhydrolase (sEH) ist ein vielversprechendes the­rapeutisches Target zur Behandlung von Bluthochdruck, Schmerz und Entzündung. Derzeit befinden sich verschiedene Inhibitoren der sEH in der pharmazeutischen Entwicklung. Um potenzielle Hemmstoffe auf ihre Eignung zum pharmazeutischen Wirkstoff te­sten zu können, sind zuverlässige Messmethoden zur Bestimmung ihrer Wirkungsstärke notwendig. Der SPE-LC-MS-Ansatz eignet sich besonders zu diesem Zweck, da er es im Gegensatz zu Hoch­durchsatzmethoden erlaubt, ein endogenes Substrat des Enzyms einzusetzen [4].

Im optimierten Online-SPE-LC-System eluieren das Substrat 14(15)-EpETrE (ein Epoxid der Arachidonsäure) und seine Hy­drolyseprodukte stabil mit distinkten Retentionszeiten und en­gen Peaks. Weiterhin kommt es, trotz der für eine Trennung mit vollständigem Lösungsmittelgradienten kurzen Trennzeit (108 s), ebenfalls zur Basislinientrennung mit dem als internen Standard verwendetem Analogon (Bild 4). Da der Enzymassay im 96-Well-Plattenformat durchgeführt wird, lassen sich schnell Dosis-Wir­kungs-Kurve und somit die Wirkstärke von sEH-Inhibitoren (sEHi) über ihre IC50-Werte bestimmen (Bild 4). Die so erzielten Werte zeigen, dass eine gute Korrelation mit den üblichen Fluoreszenz-HTS-Methoden bestand (Bild 3). Jedoch überschätzt oder unter­schätzt die HTS-Methode für einige sEHi substanzspezifisch die Wirkstärke der Substanzen. Für TCC ergab beispielsweise eine Fluoreszenz-basierte HTS-Methode einen IC50-Wert von 40 nM, während ein auf Radiometrie basierendes Verfahren eine geringe Wirkstärke mit einem IC50-Wert von nur 400 nM anzeigte. Die Online-SPE-LC-MS-Methode belegte unter Verwendung eines natürlichen Substrates des Enzyms, dass TCC ein potenter Inhibi­tor der löslichen Epoxidhydrolase ist (Bild 4).

Dieses Beispiel zeigt, dass nur mit LC-MS-basierten Methoden, die das endogene Substrat des Enzyms verwenden, verlässliche Daten über die Wirkstärke von Enzyminhibitoren gewonnen wer­den können. Weiterhin war der SPE-LC-MS-Ansatz wesentlich sen­sitiver als die HTS-Verfahren: Eine Quantifizierung der Wirkstärke für sEHi war für IC50 bis in den Picomol-Bereich möglich. Somit war der Online-LC-MS-Assay in der Lage, auch potente Inhibitoren an­hand ihrer Wirkungsstärke zu differenzieren.

Mit einer Analysezeit von rund 20 min für einen Inhibitor (zwölf Verdünnungen) kann die Online-LC-MS-Methode natürlich nicht mit HTS-Verfahren mithalten, bietet aber Ergebnisse höherer Qualität (High Content Screening vs. High Throughput Screening).

Fazit

LC-ESI-MS gekoppelt mit Online-SPE ist ein vielversprechendes, einfach zu etablierendes Analysenverfahren, das eine schnelle, direkte Probenvorbereitung ermöglicht, somit Zeit spart und darü­ber hinaus vielseitig einsetzbar ist.

Ein besonderer Vorteil des Systems ist, dass es sich direkt auf Standard-LC-Geräten (max. Druck

Literatur

[1] N. H. Schebb, B. Inceoglu, T. Rose, K. Wagner, B. D. Hammock, Anal Methods 2010, 3, 420.

[2] B. Inceoglu, K. M. Wagner, J. Yang, A. Bettaieb, N. H. Schebb, S. H. Hwang, C. Morisseau, F. G. Haj, B. D. Hammock, Proc Natl Acad Sci U S A 2012, 109, 11390.

[3] Schebb, N. H.; Inceoglu, B.; Morisseau, C.; Ahn, K. C.; Gee, S. J.; Hammock, B. D. Environ Sci Technol 2011, 45, 3109-3115..

[4] N. H. Schebb, M. Huby, C. Morisseau, S. H. Hwang, B. D. Ham­mock, Anal Bioanal Chem 2011, 400, 1359.

*) AB SCIEX Darmstadt
**) Tierärztliche Hochschule Hannover, Institut für Lebensmitteltoxikologie und Chemische Analytik.

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