Virale Vektoren und andere Partikel im Life-Science-Bereich untersuchen

Lichtstreuung zur biophysikalischen Charakterisierung

Der Autor beschreibt die Lichtstreumethoden MALS und DLS in Kombination mit Trennmethoden als Verfahren zur Charakterisierung von Partikeln im Life-Science-Bereich.

Lichtstreuung in Kombination mit Methoden zur größenbasierten Trennung stellt eine Reihe leistungsstarker Techniken für die Analyse von viralen Vektoren und Nanopartikeln dar. Wichtige Parameter wie Aggregation, Verkapselung und Konzentration können in wenigen Minuten bestimmt werden, wobei sich zeigte, dass die Analyseergebnisse robust und reproduzierbar sind. Die hier beschriebenen Methoden eignen sich auch in den Life Sciences zur Charakterisierung von Partikeln, wie z. B. von Genträgersystemen.

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Die Bedeutung der Charakterisierung von Partikeln im Life-Science-Bereich wird am Beispiel von Genträgersystemen deutlich. Bei der Gentherapie werden meist Viruskapside und virusähnliche Transportmittel verwendet, um Wirkstoffe in die Zellen von Patienten zu transportieren, in der Hoffnung, genetische Störungen zu heilen, chronische Krankheiten zu behandeln oder Krebs zu bekämpfen. Um die Sicherheit und Wirksamkeit einer Gentherapie auf der Basis viraler Vektoren zu gewährleisten, ist es von entscheidender Bedeutung, kritische Qualitätsmerkmale (CQAs) wie Partikelgröße, Konzentration, Payload (z. B. das Verhältnis von leeren zu vollen Kapsiden) und Aggregationsgrad zu identifizieren, zu charakterisieren, zu verstehen und zu überwachen.

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Bild 1: Stabilitätsscreening mit dem „DynaPro®“ Plate Reader. Links: Einfluss der AAV-Konzentration auf die Aggregatbildung. Mitte: Untersuchung des Einflusses verschiedener Additive auf die Bildung von AAV-Aggregaten. Rechts: Messung der Temperaturstabilität eines AAV-Produkts in Abhängigkeit von Konzentration und Pufferkomposition. © Wyatt Technology Corporation

Die Lichtstreuung ist ein direktes physikalisches Mittel zur Messung mehrerer solcher Parameter. Die Messungen können auf zwei Arten erfolgen. Bei der ersten, der sog. Mehrwinkel-Lichtstreuung (MALS; multi-angle light scattering), wird die Intensität des gestreuten Lichts als Funktion des Streuwinkel über eine Zeitskala von etwa einer Sekunde gemessen. MALS kann die molare Masse des Moleküls oder der Nanostruktur unabhängig von dessen Form liefern. MALS bestimmt auch den Gyrationsradius, einen über die Masse gemittelten Radius. Die zweite Form der Lichtstreuung ist die Dynamische Lichtstreuung (DLS), bei der die Intensitätsschwankungen des gestreuten Lichts auf einer Millisekunden-Zeitskala gemessen werden. DLS liefert ein direktes Maß für den translatorischen Diffusionskoeffizienten, der dann zur Berechnung des hydrodynamischen Radius verwendet wird.

Dynamische Lichtstreuung

DLS ist als Screening-Instrument sehr nützlich und wird z. B. in der Prozessentwicklung oder zur Kontrolle in der Produktion eingesetzt. Mit einer kleinen Probenmenge können Größenverteilung, Aggregation und Partikelkonzentration bestimmt werden. Da es sich um eine direkte physikalische Messung handelt, kann sie in der Regel ohne weitere Methodenentwicklung eingesetzt werden. Die Messungen sind zerstörungsfrei und dauern oft weniger als 30 Sekunden pro Probe.

Anwendungsbeispiele für DLS-Screenings sind in Bild 1 dargestellt. Bei den Proben in diesem Beispiel handelt es sich um Adeno-assoziierte Viren (AAVs). Im ersten Beispiel (links) wurde die konzentrationsabhängige Probenaggregation untersucht. Die Probe wies bei einer Konzentration von 1 x  1014 m/l eine erhebliche Aggregation auf. Eine Verdünnungsstudie ergab, dass diese Aggregate reversibel waren und bei niedrigeren Konzentrationen verschwanden. In einer zweiten Studie (Mitte) wurden verschiedene Pufferadditive untersucht, um festzustellen, welche für die Auslösung der Aggregation verantwortlich sind. Zuletzt wurde die Probe auf ihre Temperaturstabilität hin untersucht. In diesem Fall zeigte sich bei allen Proben der Beginn der Aggregatbildung bei etwa derselben Temperatur, unabhängig von der Konzentration oder den Pufferkomponenten.

SEC-MALS

Die kombinierte Technik SEC-MALS eignet sich zur Charakterisierung kleiner Viren sowie von Proteinen, Polymeren und Polypeptiden. In Verbindung mit UV- und Brechungsindex (RI)-Detektion zur Charakterisierung von Proteinen kann SEC-MALS Informationen über Konjugation, oligomeren Zustand, Molekulargewicht, Aggregation, Struktur, reversible Assoziation und den UV-Extinktionskoeffizient liefern.

Durch die Kombination von Lichtstreuung und Konzentrationsbestimmung aus zwei Signalquellen können AAV-Partikelkonzentration, Kapsidgehalt und Aggregationsgrad ohne vorherige Kalibrierung bestimmt werden. AAVs sind im Wesentlichen Konjugate aus DNA und Protein und können daher in einer SEC-MALS-UV-RI-Konjugat- analyse untersucht werden. Die Konjugatanalyse zeigt das Molekulargewicht und die Massenkonzentration sowohl der Proteinkapside als auch der DNA getrennt auf, woraus sich das Verhältnis von leeren zu vollen Kapsiden ergibt.

Bild 2: Kalibrierungsfreie Quantifizierung des Verhältnisses von Kapsidkonzentration (Cp) und viraler Genomkonzentration (Vg). Es zeigte sich, dass die SEC-MALS-Ergebnisse dem erwarteten Gehalt an Befüllung für die AAV-Proben entsprechen. © Wyatt Technology Corporation

Bild 2 zeigt Messungen von mehreren Proben mit unterschiedlichen Verhältnissen von leeren zu vollen Kapsiden. Die einzige Annahme bei der Analyse der Partikelkonzentration ist, dass eine 100-prozentige Rückgewinnung von der SEC-Säule erfolgt. Es hat sich gezeigt, dass diese Annahme bei der hier verwendeten SEC-Methode im Allgemeinen gültig ist. Da die Reihenfolge der SEC-Elution auf der Größe basiert, ist es auch möglich, den Aggregationsgrad der Probe zu bewerten und zu quantifizieren.

Die SEC-MALS-Analyse kann jedoch nicht zwischen Kapsiden mit einem partiellen Genom und einer Mischung leerer und voller Kapsiden unterscheiden. Das Vorhandensein von partiellen AAVs beeinträchtigt jedoch nur die Genauigkeit, nicht aber die Präzision der Messung des Kapsidgehalts. Auch die Bestimmung der Gesamtkonzentration der AAV-Partikel wird durch das Vorhandensein partieller AAVs nicht beeinträchtigt.

Die SEC-MALS-Methode bietet viele Vorteile bei der Messung der AAV-CQAs in einem einzigen Lauf. Sie erfordert eine minimale Probenmenge mit einer Konzentration in der Größenordnung von mindestens 1011 Partikel/ml. Darüber hinaus sind die in der Methode enthaltenen Probenparameter auf fast alle Serotypen anwendbar.

FFF-MALS und FFF-DLS

Ab einer bestimmten Partikelgröße stoßen SEC-Säulen an ihre Grenzen. Hier kann die Feldflussfraktionierung (FFF) für die Trennung von Nanopartikeln, einschließlich größerer Viren wie Adenoviren und Lentiviren sowie großer AAV-Aggregate, zum Einsatz kommen. In Kombination mit MALS kann mit FFF die Größenverteilung mit hoher Auflösung bestimmt werden und eine ähnliche Charakterisierung wie mit SEC-MALS erhalten werden.

Wie bei der SEC wird die Trennung bei der FFF durch das hydrodynamische Volumen bestimmt. Doch die FFF basiert auf der Trennung im Flussfeld und nicht auf der Wechselwirkung mit einer stationären Phase. Sie kann daher auch für Proteine verwendet werden, die dazu neigen, an SEC-Säulen zu adsorbieren. Sie eignet sich auch besser für Partikel und Moleküle, die zu groß für eine einfache SEC-Analyse sind oder einen Molekulargewichtsbereich aufweisen, der für die Trennung auf einer einzigen SEC-Säule ungeeignet ist.

Bild 3: Feldflussfraktionierung als alternatives Trennverfahren zur SEC. In einem Kanal, der nur mit Flüssigkeit gefüllt ist, wird das Probengemisch durch das Wirken unterschiedlicher Flüsse zunächst fokussiert und anschließend durch das Zusammenspiel von Kanal- und Querfluss anhand der hydrodynamischen Größe getrennt. © Wyatt Technology Corporation

Der typische Aufbau einer FFF ist in Bild 3 dargestellt. Eine Nettoabwärtsströmung – oder auch „Querströmung“ – konzentriert die Partikel gegen die Membran am Boden des Kanals. Die Partikeldiffusion wirkt dieser Konzentration entgegen. Kleinere, schneller diffundierende Partikel gelangen daher weiter nach oben in den Kanal. Eine zweite Längsströmung transportiert die Partikel entlang des Kanals. Aufgrund des parabolischen Strömungsprofils erfahren Partikel, die weiter nach oben in den Kanal diffundieren, einen höheren durchschnittlichen Querstrom und werden schneller aus dem Kanal gespült. Die Elutionsreihenfolge ist gegenüber SEC umgekehrt, d. h., kleine Partikel eluieren zuerst.

Zur Quantifizierung der AAV-Aggregation wird FFF empfohlen, um die Ergebnisse von SEC zu bestätigen, da die SEC-Säule einen Teil der AAV-Aggregate entweder durch Säulenfiltration oder Scherabbau entfernen kann. Neben AAV und großen viralen Vektoren wird FFF-MALS auch für die Analyse von Lipid-Nanopartikeln und extrazellulären Vesikeln eingesetzt, da die Trennung äußerst „sanft“ zur Probe ist.

Bild 4: Untersuchung von LNPs mit Hilfe von verschiedenen Analysemethoden basierend auf dem Prinzip der Lichtstreuung. Mittels DLS können zunächst nur subtile Unterschiede in den Proben identifiziert werden (links). Durch FFF-MALS wird die Probe vor der Analyse nach hydrodynamischer Größe aufgetrennt, wodurch eine detailliertere Analyse erzielt wird (Mitte). Des Weiteren kann durch FFF-MALS auch die Menge an im LNP enthaltene mRNA bestimmt werden (rechts). © Wyatt Technology Corporation

Drei Proben von Lipid-Nanopartikeln (LNPs) wurden zunächst mittels DLS untersucht. Wie in Bild 4 zu sehen ist, sind die Unterschiede recht subtil. Mit FFF-MALS ist eine weitaus detailliertere Größenverteilung für jede Probe zu erkennen. In Kombination mit UV-Absorptions- und dRI-Detektoren ist es möglich, die eingekapselte mRNA zu quantifizieren, entweder durch Beobachtung der Unterschiede im Molekulargewicht von Lipiden und mRNA oder durch direkte Messung des Peaks der freien mRNA.

Zusammenfassung

Die beiden Lichtstreumethoden MALS und DLS eignen sich zur Quantifizierung und zur Beurteilung von viralen Vektoren und anderen Nanopartikeln wie Liposomen, LNPs und extrazellulären Vesikeln. Da SEC und FFF verschiedene Größenbereiche und Verfahren abdecken, ergänzen sie sich. So ist es auch möglich, eine Methode zur Hand zu haben, wenn die andere aufgrund von Einschränkungen nicht eingesetzt werden kann.

AUTOR
Dr. David Golonka
Wyatt Technology Europe GmbH, Dernbach
Tel.: 02689/925-0
info@wyatt.eu
www.wyatt.com

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