Ein Rückblick auf die HPLC2015

Trends in der HPLC

Vom 22. bis 25. Juni 2015 fand in Genf die HPLC2015, das „42. International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques“, statt. Diese Tagung ist die mit Abstand wichtigste auf dem Gebiet der HPLC und verwandter Techniken.

HPLC2015 in Genf: 42. International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques

Es ist eine sehr gelungene Tagung gewesen, nahezu alles war perfekt: Von der Örtlichkeit über die Organisation bis hin zum Fachlichen hat alles gepasst. Die Anzahl der Poster und der Aussteller wahr wohltuend kleiner als sonst und somit zu „bewältigen“. Nun kurz zum Wissenschaftlichen: Auffallend bei der diesjährigen Tagung war, dass etwas Großes, etwas völlig Neues, gefehlt hat. Vielmehr hat man sich sehr ruhig, ja fast demütig und intensiv über zunächst banal anmutende Themen wie Temperatur, pH-Wert und Wasseranteil im Eluenten ausgetauscht. Erst in den letzten Jahren erkennt man peu a peu - hier haben die neuen Techniken wie UHPLC und Core-Shell-Technologie einen entscheidenden Beitrag geleistet - wie komplex die HPLC eigentlich ist und wie stark alles mit allem zusammenhängt. Doch später mehr dazu.

Folgendes ist aus meiner Sicht erwähnenswert: Mittlerweile bieten fast alle Säulenhersteller „Bio“-Säulen für die Trennung von Peptiden und Proteinen an. HILIC befindet sich nach erfolgter Einführung nun im Stadium des „Verstehens“: Sehr viele Vorträge und Poster über mögliche Mechanismen, über Modelle, etc. Etwas zeitversetzt folgt die SFC: Das Promoten seitens der Firmen ist in vollem Gange, in den nächsten 2...3 Jahren dürfte die Beschäftigung mit der Theorie an Dynamik gewinnen.

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Für viele Anwender war der Sprung von der HPLC zur „echten“ UHPLC offensichtlich zu schnell. Die Gerätehersteller waren mit den Verkaufszahlen wohl nicht ganz zufrieden, Ergebnis: Alle drei Großen bieten mittlerweile etwas dazwischen an, das sind HPLC-Geräte, „UHPLC-like“ (ca. 650...1000 bar), nach dem Motto: „Lieber Kunde, kauf doch jetzt etwas Modernes, Robustes und mach´ weiterhin das, was Du die ganze Zeit gemacht hast und was Du auch kennst – nur besser als bis dato“.

Dauerthemen der letzten Jahre wie zum Beispiel 2D-Chromatographie, Miniaturisierung und Kopplungen haben natürlich nicht gefehlt, allerdings standen eher Applikationsbeispiele im Vordergrund, der Kreis wiederholt sich offensichtlich: Einführung, Theorie, Anwendung.

Zahlen, Eindrücke, etc…

Die HPLC2015 war mit knapp 1100 teilnehmenden Personen eine recht gut besuchte Tagung. Abzüglich Herstellern, Vortragenden und Poster-Autoren kamen ca. 200...250 reine Besucher nach Genf. Es wurden ca. 600 Poster vorgestellt; ferner konnte man aus insgesamt 93 Plenarvorträgen, Tutorien und Firmenpräsentationen das Passende aussuchen. Nachfolgend in Kürze ein paar – wenn auch subjektive – Eindrücke:

Neutral:

  • Sehr enge Zusammenarbeit zwischen Forschungs-Instituten bzw. Universitäten mit der Industrie/den Geräteherstellern. Kaum ein Vortrag seitens einer Universität ohne „sponsored by…“
  • Verglichen mit der jüngsten Vergangenheit, relativ geringe Anzahl an Besuchern aus Asien, was verständlich ist: Zum einen dort eine Schwestertagung, zum anderen wachsende Anzahl an Kokurrenzveranstaltungen überall in Asien.

Positiv:

  • Ich mach´s kurz, weil eben alles gut war: perfekter Tagungsort, Getränke und Kaffee reichlich, gut, stets vorhanden, keine Warteschlangen, exzellente Küche.
  • Das Fehlen von übertriebenen „Show-Elementen“ gepaart mit der sachlich geführten, intensiven Diskussion zwischen Herstellern und Besuchern empfand ich als sehr angenehm.

Eine gaaanz kleine Kritik:

Vier parallele Sessions; man kann hier sicherlich geteilter Meinung sein, aber die Entscheidung fiel oft schwer. Ich habe nach weiteren Kritikpunkten gesucht, es ist mir jedoch nur äußerst knapp gelungen, gerade noch zwei winzige zu finden:

1. Wenn ich mich nicht irre, ist es bei dieser Tagungsserie das erste Mal überhaupt gewesen, dass im Plenarsaal Blumen gefehlt haben. Bei teilweise recht trockenen Themen täte der Blick eines großen bunten, schönen Blumenstraußes gut…

2. Genf ist bekanntlich recht französisch geprägt. Ich kann mich erinnern, in Nizza war das Gleiche in Grün: Zwar eine hervorragende Küche, aber man bekam mittags nur ein Löffelchen und ein Messer zum Essen. Im erweiterten französischen Raum müssen Gabeln wohl recht teuer sein, seien sie auch nur aus Plastik…

Geräteentwicklung

Die Geräte-Hybridtechnologie hat das Industrie-Labor längst noch nicht erreicht, aber sie dürfte doch eine Zukunft haben. Das was Waters und Agilent bereits vor 5...6 Jahren begonnen haben und jetzt mit der SFE-SFC/MS-Anlage von Shimadzu weiter geführt wird, dürfte langsam aber stetig an Bedeutung gewinnen: Flexible Geräte, die je nach Bedarf im HPLC- oder SFC-Modus oder aber in Form einer LC-SFC-MS- oder wie auch immer gearteten Kopplung betrieben werden. Halten wir als Tendenz wie folgt fest: Es wird erhöhte Flexibilität geboten.

Weitere Beispiele dazu wären der 1290 Infinity II Autosampler von Agilent mit zwei unabhängigen Injektionspfaden („Dual Needle System“) oder die „Multi Flow Technology“ von Waters. Aber auch Folgendes wird beobachtet: Man bietet den Kunden Geräte mit etwas „schlechteren“ Spezifikationen als jene der eigenen Spitzenprodukte an, dafür aber robuster, einfacher, maßgeschneidert für eine bestimmte Zielgruppe (z.B. Pharma), also weniger „sophsticated“ – und wesentlich günstiger. Man denke an Vanquish Flex von ThermoScientific (ca. 1000 bar) oder Ac- quity Arc UHPLC von Waters (ca. 650 bar). Die Anwender profitieren von der starken Konkurrenz: Es gibt heute hervorragende Geräte für jedes Portemonnaie und für nahezu jede Anwendung: Von dem günstigen, modernen und robusten HPLC- bis hin zum Super- UHPLC-Gerät. Der Wechsel von Geräteteilen ist derart vereinfacht, dass eine Gerätequalifizierung (geregelter Bereich, GMP-Umgebung) nahezu entfällt.

Medizin und Biologie machen das Rennen

In der analytischen Forschung stellen Medizin und Biologie wahrscheinlich diejenigen Bereiche mit den größten Wachstumsraten dar. „Med“ und „Bio“ treiben die Entwicklung an; somit beherrschen „…omics“ seit Jahren die Szene. Es besteht ein großer Bedarf für spezifische, empfindliche Methoden; der Forschungs- und damit auch der analytische Fokus ist beispielsweise auf eine einzelne Zelle oder gar Zellbereiche gerichtet. Und da ja das wirtschaftliche Potential hier enorm ist, versuchen die Hersteller Produkte speziell für diesen Bereich zu entwickeln. Dazu einige Beispiele:

Man spricht etwas selbstironisch von „Stamp“ (Separation Technology for a Million Peaks): Im Rahmen des Proteom-Projektes müsste man ca. 50 000 Proteine trennen („separated, non differentiated“)– es wird eine Peakkapazität von 1 000 000 benötigt. Es ist völlig klar, dass dies Zukunftsmusik ist, diese Richtung jedoch beeinflusst das Design der zu entwickelnden Produkte, z.B: Nahezu alle Firmen bieten Säulen auf Polymer- und vor allem auf 300-Å-Kieselgelbasis für die Trennung von Peptiden und Proteinen an. Ferner: Die Metabolomics-Forschung verlangt nach Säulen mit guter Selektivität für kleine polare Moleküle: Immer mehr HILIC-Säulen werden vorgestellt.

Um sich der geforderten Nachweisgrenze möglichst zu nähern, strebt man ein „0-Totvolumen“ integriertes System an, „Autosampler-Säule-Detektor“: Kapillarfreie Injektion, „on-tube-Detection“. Vereinfacht gesagt: Die heutigen Säulen sind viel zu gut für die heutigen Geräte; nach einer Phase der relativen Ruhe dürfte in den nächsten Jahren gerätetechnisch einiges passieren, denn: Am Säu-lenein- und –ausgang verliert man bei kurzen Säulen ca. 30...40 % an Effizienz.

Die Zahl der HPLC-Anwender, die keine Analytiker sind, wächst. Diese Entwicklung wurde von den Herstellern erkannt und sie wird immer mehr beim Geräte- und Softwaredesign berücksichtigt: Gerätebedienung, Methodenentwicklung und Data-Handling sollen intuitiv, einfach und robust sein. Man rechnet damit, dass zukünftig in vielen Labors in den Life Sciences Know-how und Zeit noch rarer werden.

SFC, HILIC, RP-HPLC

SFC, „der alte Newcomer“, erlebt zurzeit zweifelsohne einen Hype; Nach Ende der 1980er Jahre und Anfang der 2000er Jahre erscheint dieser dritte Anlauf erfolgsversprechender. War früher die SFC im Wesentlichen „nur“ eine Alternative für präparative Trennungen im Normal Phase-Modus (chirale Trennungen, Isolierung organischer Substanzen), erobert sie heute immer mehr Analytikfelder. Diese Entwicklung wird von folgenden drei Faktoren begünstigt: In der Zwischenzeit robuste, leicht zu händelnde Geräte, Erweiterung der Anwendungsbereiche durch immer mehr Modifier in der mobilen Phase sowie die Kopplung mit der MS. Es wird erwartet, dass auf den nächsten Tagungen eine gründliche Auseinandersetzung über die Dinge erfolgt, die im überkritischen Zustand tatsächlich ablaufen – die Entwicklung theoretischer Modelle steht noch bevor.

HILIC hat ihre „Feuertaufe“ hinter sich; sie hat es zwar immer noch recht schwer, sich auf breiter Basis zu etablieren. Aber sie kommt, wenn schon auch langsam, und dies dank der wachsenden Zahl interessanter, polarer Verbindungen. Und sie wird immer wertvoller als Kopplungspartner der RP. Viele Vorträge in Genf befassten sich mit den Mechanismen in der

HILIC. So beeinflusst beispielsweise die Dicke der Wasserschicht an der Oberfläche der stationären Phase Peakform, Selektivität, Beladbarkeit und Reproduzierbarkeit stark. Und diese Dicke selbst wiederum wird von vielen Faktoren beeinflusst. Die „Good News“ dabei: Durch das Beachten einiger wenigen, aber entscheidenden Regeln kann auch ein RP-verwöhnter Anwender mit HILIC seine Freude haben.

Und RP, die „alte Dame“? Die RP-HPLC- Pioniere sind verstorben oder aber, bis auf wenige Ausnahmen (Berry Karger, Pavel Jandera), bleiben altersbedingt solchen Tagungen meist fern (Joseph Kirkland, Lloyd Snyder). Mit was beschäftigen sich nun deren Nachfolger? Ein sowohl „back to the roots“ als auch „Zukunft gestalten“. Ich gewinne den Eindruck, dass heute die Zusammenarbeit zwischen Hochschulen und Instituten einerseits und Industrie/Geräteherstellern andererseits intensiver, unverkrampfter und offener ist. Und das ist zunächst einmal gut so: Die Hersteller bekommen einen schnellen und guten Input, die Geräte sind gut. Nur: Oft haben Entscheider bei den Firmen die große Masse der Anwender nicht im Blick, manch eine Geräteentwicklung geht an ihnen vorbei. Desweiteren ist für manchen Software-Entwickler „Analytik“ offensichtlich immer noch ein Fremdwort. Halten wir also fest: Forschende HPLC-Anwender profitieren als erste von hervorragenden Entwicklungen (2D, Miniaturisierung, 1,5 µm, Kapillar-LC-Ionenmobilität). Die guten, robusten Routinegeräte erobern in einem zweiten Schritt den Markt.

Zum Schluss möchte ich kurz am Beispiel der Temperatur skizzieren, wieso man sich nach fast 50 Jahren HPLC auf wissenschaftlichen Tagungen in Postern, Vorträgen und auch Tutorien (so ein sehr gutes Tutorium mit Frank Steiner und Thorsten Teutenberg) immer noch, oder eher wieder, mit solchen „banalen“ Angelegenheiten beschäftigt:

Die Temperatur beeinflusst sowohl die Kinetik (Effizienz, Peakform) als auch die Thermodynamik (Selektivität). Nehmen wir an, die Temperatur erhöht sich. Was kann alles passieren? Nachfolgend stichwortartig einige Konsequenzen:

  • Freie Silanolgruppen dissoziieren stärker, Ionenaustauschwechselwirkungen nehmen zu. Dies beeinflusst Peakform und Retentionszeit.
  • Der pH-Wert ändert sich, gleiche Konsequenz wie oben.
  • Das Minimum der Van-Deemter-Gleichung verschiebt sich nach rechts; man müsste bei höheren Flüssen arbeiten, um eine maximale Bodenzahl zu erzielen.
  • Temperaturerhöhung führt zu einer Veränderung der Solvatisierungsenergie, zu einer Änderung der Dicke einer eventuell vorhandenen Wasserschicht an der Oberfläche der stationären Phase, beeinflusst Dissoziations- sowie weitere Gleichgewichte, so z.B. die Dimerisierung. Das betrifft nicht nur die Probenmoleküle, sondern auch (evtl. unterschiedliche) die funktionellen Gruppen der stationären Phase. Eine stärkere Temperaturhöhung macht das Wasser schließlich apolarer.

Jetzt nehmen wir an, die Moleküle in der Probe haben unterschiedlichen chemischen Charakter (Peptide, Proteine mit sauren und basischen Gruppen). Oder nehmen wir an, es wurden zwei Trennungen durchgeführt; einmal war es ein HPLC-Lauf und einmal ein UHPLC-Lauf mit einer 1,7-µm-Säule. Im zweiten Fall liegt die Temperatur am Ende der Säule aufgrund der Reibungswärme um ca. 18...20 °C höher als eingestellt, im ersten Fall bleibt sie gleich.

Man verwendet einen Vorheizer – oder aber nicht – man verwendet einen Säulenofen, der adiabatisch arbeitet – oder eben diabatisch – oder man hat einmal eine 2,1-mm-Säule und das nächste Mal eine 4,6-mm-Säule, in einem Fall herrscht neben dem longitudinalen auch ein radialer Temperaturgradient – im anderen eben nicht… Diese Auflistung lässt sich wirklich fast beliebig erweitern. Man erkennt vielleicht, wieso eine gewollte oder unbeabsichtigte Änderung der Temperatur zu „allem“ führen kann: Verschlechterung/Verbesserung der Peakform sowie der Auflösung und der Nachweisgrenze, Koelution, auch die Anzahl der Peaks kann sich ändern, schließlich auch die Elutionsreihenfolge. Mancher Anwender stellt nun eine solche Änderung fest, bringt sie allerdings nicht unbedingt mit der „harmlosen“ Temperatur in Zusammenhang. Man wird sich noch einige Zeit damit bechäftigen müssen, will man das Geschehen in der HPLC ein wenig besser verstehen.

Zwei, drei Worte zum Schluss

Auch diesmal hätte ich mir mehr Vorträge aus der Industrie gewünscht. Auch diesmal hätte ich mir mehr Seriosität von einigen Säulenherstellern gewünscht: Man zeigt Vergleichschromatogramme, um zu beweisen, dass die eigene Säule um soundsoviel Prozent mehr Böden liefert als die Konkurrenz – nur: Die chromatographischen Bedingungen sind nicht vergleichbar: Unterschiedliche Chemie der Oberfläche trotz zweier „C18-Säulen“, damit unterschiedliche Wechselwirkungen, damit unterschiedliche Kinetik, damit unterschiedliche Bodenzahl, obwohl die Säule der Konkurrenz vielleicht besser gepackt gewesen ist.

Auch diesmal war ich vom Interesse der Besucher angetan: Trotz des tollen Wetters war die Sonnenterasse während der Vorträge fast leer (ich war nur kurz dort, um es feststellen zu können…). Und auch diesmal war die Qualität der Poster hervorragend. Von den Anwendungsgebieten her war die Anzahl der Poster aus dem Bereich Bio/Pharma mit Abstand am höchsten, (ca. 100), gefolgt von Lebensmittel (38) und Umwelt (26). Was die anderen Themen betrifft, waren die Themen „Fundamentals“, „LC-MS-Kopplung“ und „Säulen“ ungefähr gleich stark vertreten (jeweils ca. 50...60), gefolgt von der Probenvorbereitung (37). Auffallend klein (nur 22) war die Anzahl der Poster zur UHPLC. Sie hat ihren Charme als Forschungsgebiet verloren und nach über zehn Jahren weiß man ja, dass in der UHPLC die Retentionszeiten kurz und die Peaks scharf sind.

Die nächsten Tagungen finden 2016 in San Francisco und 2017 in Prag statt.

Dr. Stavros Kromidas

66440 Blieskastel

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