Polymeranalytik

Anwendung von AF4-MALLS

zur Charakterisierung dendritischer Polymere und ihres Komplexierungs- und Aggregationsverhaltens
Bild 4: AF4-MALLS-Messung verschiedener Generationen und b) Strukturbestimmung der Aggregate.
Dendritische (verzweigte) Polymere genießen ein stetig steigendes wissenschaftliches Interesse. Dies ist vor allem ihren breit gefächerten Eigenschaften zuzuschreiben, die bedarfsgerecht gestaltet werden können. Speziell gilt das für die Klasse der hoch verzweigten Polymere mit einer Vielfalt an Verwendungen [1]. Ein wichtiges kommerzielles Einsatzgebiet bildet dabei die Verwendung als multifunktionelle Bestandteile in Beschichtungsmaterialien und Harzen. Darüber hinaus gewinnen Untersuchungen an Bedeutung, in denen man den Einsatz solcher Polymere im biomedizinischen und pharmazeutischen Bereich prüft. So kann beispielsweise die Verkapselung oder Komplexbildung mit Wirkstoffen zu neuartigen Formulierungen und Darreichungsformen von Medikamenten führen.

Hoch verzweigte Polymere sind vielversprechende, dreidimensionale Nanostrukturen, die in ihrer Peripherie mit einer Vielzahl an funktionellen Gruppen ausgestattet sind. Zudem befinden sich in ihrem Gerüst verschiedenartig ausgeformte Kavitäten (Bild 1a). Dabei lassen sich Biokompatibilität ebenso wie Nicht-Toxizität des Grundgerüsts durch Modifizierung der funktionellen Endgruppen sicherstellen (Bild 1b). So ist etwa die Toxizität des mit Oligosacchariden modifizierten Polyethylenimins (PEI) deutlich abgeschwächt, während sich gleichzeitig seine Fähigkeit, Wirkstoffe transportieren zu können, erhöht [2]. Als weiteres Beispiel seien die mit Lysin dendronisierten (kaskadenartig verzweigten) Maleimid-(MI)-Glykopolymere genannt (Bild 1c). Diese verfügen bei einer sehr hohen Molmasse über eine große Anzahl an funktionellen Gruppen. In Abhängigkeit von der Art der Verzweigung und der Zahl an Endgruppen neigen die Moleküle zu einer verstärkten Bildung von Aggregaten [3]. Hinzu kommen eine besondere pH-Empfindlichkeit sowie spezielle Bindungseigenschaften für Farbmoleküle. Nimmt man alle diese Merkmale zusammen, so hat man es hier mit stark variablen, hoch komplexen Molekülgebilden zu tun.

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Aus diesem Grund ist es kaum verwunderlich, dass man zu deren eingehender Charakterisierung entsprechend leistungsfähige Methoden benötigt. Die asymmetrische Fluss-Feldflussfraktionierung (AF4) in Kombination mit Lichtstreudetektion (Multi Angle Laser Light Scattering, MALLS) ist in der Lage, dies zu leisten, denn sie erlaubt die schonende Auftrennung hochmolekularer Aggregate, ohne dass diese durch das Auftreten von Scherkräften zerstört werden [4]. Überdies lässt sich der Filtrationseffekt, der durch die Membran hervorgerufen wird, beispielsweise dazu nutzen, das Verhältnis von Polymer-gebundenen zu freien Farbmolekülen zu quantifizieren.

Verteilung der Molmassen

Üblicherweise erfolgt die Auftrennung von Polymergemischen mithilfe der Größenausschlusschromatographie (Size Exclusion Chromatography, SEC). Diese Methode beruht auf einer ausgewogenen Wechselwirkung zwischen Säulenmaterial, Lösungsmittel und der zu untersuchenden Polymerprobe. Um eine vollständige Trennung nach der Größe zu bewerkstelligen und verlässliche Aussagen über die Polydispersität treffen zu können, müssen zu starke Interaktionen zwischen Säule und Probe ausgeschlossen sein. Das ist bei dendritischen Polymeren jedoch keineswegs immer sichergestellt, besitzen diese doch eine multifunktionale Architektur, wodurch solche Wechselwirkungen begünstigt werden. Mehrfach wurde über dieses Problem im Zusammenhang mit steigenden Molmassen berichtet [5].

Bild 2a zeigt das Beispiel eines voll-aromatischen, hoch verzweigten Polyesters, der mittels SEC-MALLS gemessen wurde. Die Beziehung zwischen Molmasse und Elutionsvolumen zeigt deutlich, dass hier kein einheitliches Trennregime vorliegt. Dies ist ein sicheres Anzeichen dafür, dass die Trennung nicht ausschließlich aufgrund der Molmasse erfolgte, denn gleiche Molmassen eluieren hier bei unterschiedlichen Elutionsvolumina. Somit lassen sich auch keine verlässlichen Angaben über die Massenverteilung machen.

Eine Lösung für dieses Problem der Trennung komplexer funktionaler Polymere bietet die AF4-Technik, die ganz ohne Säule arbeitet. Interaktionen zwischen der verwendeten Membran und der Probe finden praktisch nicht statt und können somit auch die Analyse nicht verfälschen. Eine detaillierte und verständliche Beschreibung dieser Technik findet man unter www. wyatt.eu. Die einzige methodische Beschränkung der AF4 liegt in der Ausschlussgröße der Membran, die je nach Porengröße beispielsweise Moleküle mit einer Molmasse unter 5000 g/mol passieren lässt. Somit ist die Untersuchung solch kleiner Molmassen mittels AF4 nicht möglich.

In Bild 2b ist eine AF4-Trennung des voll-aromatischen Polyesters mit einer großen Anzahl phenolischer Gruppen mit dem Wyatt Eclipse-System dargestellt. Im Gegensatz zur SEC-Trennung zeigen die ermittelten Molmassen hier eine eindeutig lineare Beziehung zum Elutionsvolumen. Ein weiterer Unterschied: Aufgrund des Trennprinzips der AF4 eluieren die niedrigen Molmassen zuerst, gefolgt von den größeren.

Charakterisierung der Komplexbildung

Dendritische Polymere mit einer Hülle aus Oligosacchariden interagieren stark mit Farbmolekülen, indem sie Komplexe mit ihnen bilden. Dieser Vorgang wird auch oft modellhaft herangezogen, um zu studieren, wie sich die Bindung und der Transport pharmakologischer Wirkstoffe durch solche polymeren Trägerstoffe bewerkstelligen lassen.

In der vorliegenden Untersuchung wurden Oligosaccharid-umhüllte Moleküle, deren Kern aus hoch verzweigtem PEI bestand, mit Rose-Bengal-Farbstoff (RB) gemischt. Aus diesem Ansatz entstand ein als RB@PEI-Mal bezeichneter Komplex [3]. Die Abtrennung nicht-gebundener Farbstoffmoleküle erfolgt üblicherweise durch Methoden wie etwa Dialyse, Ultrafiltration oder auch Ultrazentrifugation. Unglücklicherweise liefern alle diese Ansätze in dem untersuchten System keine quantitativen Daten. Dies liegt daran, dass die Bindung des Farbstoffes in unterschiedlichen Bereichen des Moleküls stattfinden kann und somit keine zuverlässige Kalibrierung ermöglicht wird.

Aus diesem Grund bedienten wir uns der AF4-Methode, nutzten dabei aber gewissermaßen einen positiven Nebeneffekt dieser Technik, der normalerweise eher unbeachtet bleibt: die Ultrafiltration, welche während der Fokussierungsphase stattfindet [6]. Dabei verlässt der nicht gebundene, frei bewegliche Anteil an RB-Farbstoffmolekülen den Trennkanal durch die Membran. Die deutlich größeren RB@PEI-Mal-Komplexe verbleiben dagegen im Inneren des Trennkanals, denn für sie ist die Membran nicht permeabel. Bild 3a zeigt eine schematische Darstellung dieses Vorgangs.

Das Probensystem wurde mittels UV-VIS-Detektion am Querflussausgang kalibriert. Die Parameter Membranmaterial, Ausschlussgröße der Membran sowie Stabilität der gelösten Komponenten RB und RB@PEI-Mal-Komplex wurden untersucht und optimiert, wobei sich eine gute Reproduzierbarkeit ergab. Die Studien zur Komplexbildung zeigten eine hohe Übereinstimmung der Messwerte mit dem anzunehmenden Anstieg der Molmasse im Zuge der Bindung des Farbstoffes an den Träger. In Bild 3b ist diese enge Korrelation dargestellt.

Aggregationsverhalten

Die Bestimmung der Molmasse dendritischer Polymere ist alles andere als ein leichtes Unterfangen, vor allem deshalb, weil man es mit sehr großen Moleküldimensionen zu tun hat. Weitere Probleme bereitet ihre Neigung, Aggregate zu bilden. Aufgrund der starken Scherkräfte bei der Säulentrennung liefert bei diesen Molekülen die Anwendung der SEC in den seltensten Fällen verlässliche Ergebnisse. Das Problem stellt sich bei der AF4-Trennung praktisch nicht. Mehr noch: Mit dieser Technik lassen sich sogar systematische Studien zur Bildung von Aggregaten unter wechselnden Bedingungen wie etwa pH-Wert und Konzentration durchführen. Ein weiterer Parameter, der die Aggregatbildung beeinflusst, ist natürlich auch der Grad der Verzweigung. Man spricht in diesem Zusammenhang auch von der so genannten Generationszahl, wobei die Anzahl an funktionellen Gruppen der Dendrimere von der ersten zur dritten Generation hin zunimmt. Im Folgenden wird die Untersuchung von Lysin-dendronisierten MI-Glykopolymeren mit einer Maltosehülle mithilfe wässriger AF4, gekoppelt an MALLS-Detektion, beschrieben.

Bild 1c zeigt schematisch den Typ von Polymeren, der analysiert wurde. In diesem Fall wurden Lysin-Dendrone an ein lineares Maleimid-Rückgrat gekoppelt und anschließend mit einer Oligosaccharid-Hülle modifiziert. In Abhängigkeit von der Verzweigungszahl, so die theoretische Erwartung, sollten sich Unterschiede im Aggregationsverhalten der Moleküle zeigen. Die systematische Untersuchung brachte ans Licht, dass es bei den einfach verzweigten Glykopolymeren der ersten Generation zu keiner nennenswerten Aggregation kam. Die dritte Generation hingegen aggregierte bereits bei sehr niedrigen Konzentrationen. Dies ist in Bild 4a zu sehen.

Im nächsten Untersuchungsschritt wurden hydrodynamischer und Gyrationsradius ermittelt und in Beziehung zueinander gesetzt. Hieraus kann man eine Aussage über die ungefähre Gestalt der Aggregate (sphärisch oder länglich) treffen. Aufgrund dieser Messungen ließ sich zeigen, dass es sich bei den Aggregaten um stäbchenförmige Gebilde handelte. Kombiniert man nun sämtliche im Zuge der AF4-MALLS-Untersuchungen gewonnenen Daten aus den Radius- und Molmassenbestimmungen, so erhärtet sich der Befund, wonach man es hier mit lateralen Aggregaten (Bild 4b) zu tun hat [7]. Dieses Ergebnis wurde später mit einer zweiten Untersuchungsmethode bestätigt, und zwar durch die Charakterisierung der Aggregate mithilfe der Rasterkraftmikroskopie.

Zusammenfassung

Die asymmetrische Feldfluss-Fraktionierung (AF4) erweist sich als eine überaus geeignete Methode für die schonende Auftrennung von gelösten Molekülen zum Zweck der nachfolgenden Charakterisierung mittels MALLS-Technologie. Da bei der AF4 fast keine Scherkräfte auftreten, kann man sie hervorragend zur Analyse des Aggregationsverhaltens hoch verzweigter Polymere heranziehen.

Überdies kann man sich den Ultrafiltrationseffekt der Trennmembran zunutze machen. Dieser ermöglicht die quantitative Bestimmung der Menge an Farbstoff, die von einem PEI-Mal-Polymer gebunden wird. Die hier geschilderten Eigenschaften der AF4 machen sie auch zu einer vielversprechenden analytischen Technologie, wenn es darum geht, neuartige molekulare Transportsysteme für pharmakologische Wirkstoffe zu untersuchen.

Referenzen

  1. Voit, B.I. and Lederer, A. Chem. Rev. 2009, 109 (11), 5924.
  2. Appelhans, D.; Komber, H.; Quadir, M.A.; Richter, S.; Schwarz, S.; van der Vlist, J.; Aigner, A.; Muller, M.; Loos, K.; Seidel, J.; Arndt, K.F; Haag, R.; Voit, B. Biomacromolecules 2009, 1,0 1114.
  3. Appelhans, D.; Komber, H.; Morgner, N.; Biernert, R.; Thünemann, A.F.; Brutschy, B.; Voit, B. Polymer Preprints 2008 49, 590.
  4. J. C. Giddings, Separation Science and Technology 19, 831, 1984
  5. M. Erber, S. Boye, T. Hartmann, B.I. Voit, A. Lederer J. Polym. Sci. Part A: Polym. Chem.2009, 47, 5158-5168.
  6. S. Boye, N. Polikarpov, D. Appelhans, A. Lederer J. Chromatogr. A 2010, 1217, 4841–4849.
  7. Burchard, W., and M. Muller. 1982. Determination of fibrin structures by light scattering. In: Fibrinogen-Recent Biochemical and Medical Aspects. A. Henschen, H. Graeff, and F. Lottspeich, editors. Walter de Gruyter Co., New York. 11-45.

Albena Lederer*, Susanne Boye*, Thomas Jocks**)

  1. Leibniz-Institut für Polymerforschung Dresden e.V., Hohe Str. 6, 01068 Dresden.
  2. Wyatt Technology Europe GmbH, Hochstr. 18, 56307 Dernbach.
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