Zuverlässige Charakterisierung eines Antikörpers über einen weiten Konzentrationsbereich

Von Nano- bis Mikrogramm

Dr. Thomas Jocks*)

Die Mehrwinkel-Lichtstreuung (MALS: multi angle light scattering) stellt eine sehr leistungsfähige Technik zur Charakterisierung von Makromolekülen wie etwa Proteinen dar. Über einen weiten Messbereich liefern MALS-Instrumente exakte Daten über Molmassen und Molekülgrößen. Dadurch lassen sich zuverlässig Monomere, Dimere oder auch höhere Aggregate identifizieren.

Die Bestimmung erfolgt, indem die Menge an Streulicht, welches von der Probe auf die in unterschiedlichen Winkeln angebrachten Detektionsdioden trifft, gemessen wird. Nun ist es grundsätzlich so, dass eine hohe Anzahl an Streuwinkeln die Qualität der Messung verbessern kann. Allerdings ist die simple Erhöhung der Winkelanzahl nicht schon per se ein Garant für gute Daten - wie ja auch die reine Vervielfältigung von Nervenzellen alleine bekanntermaßen kein leistungsfähigeres Nervensystem ergibt. Es muss gleichzeitig ihre Verschaltung optimiert werden.

Genau so sieht es mit Lichtstreu-Detektoren aus: Die Messdaten führen nur dann zu einem detaillierten, verlässlichen Bild, wenn sie mithilfe hoch entwickelter mathematischer Algorithmen verarbeitet werden. Dass die Lichststreugeräte der DAWN-Serie von Wyatt Technology über diese Voraussetzung verfügen, wird im Folgenden dargestellt. Wir zeigen dies hier anhand der exakten Charakterisierung eines Antikörpers über einen großen Konzentrationsbereich hinweg.

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Material und Methoden

Unterschiedliche Mengen (200 ng - 500 µg) eines gegen Leukozyten-Antigene gerichteten Antikörpers wurden aufgetrennt und analysiert. Dabei kam ein Agilent 1260 Infinity Bio-inert LC-System zum Einsatz, das an eine Superdex 200 SEC-Säule gekoppelt war. Die Detektion erfolgte mittels Infinity VLDioden-Array-Detektor, die Konzentrationsbestimmung mit einem Differential-Refraktometer Wyatt Technology Optilab T-rEX. Die Molmassen wurden durch ein Wyatt Technology Dawn Heleos II MALS Instrument bestimmt. Das gesamte System war so ausgelegt, dass eine unspezifische Reaktion des Antikörperproteins mit den Oberflächen der Analysengeräte ausgeschlossen werden kann.

Ergebnisse und Diskussion

Messung der Molmasse und der Konzentration des Antikörpers: Bild 2 zeigt die Detektorsignale, die nach Injektion des Antikörpers in das System aufgezeichnet wurden. Wie zu erwarten war, variieren die Peaks aus dem RI-Detektor, der die Konzentration an Protein bestimmt, zwischen den verschiedenen Läufen, da ja auch unterschiedliche Mengen eingesetzt wurden. Im Gegensatz dazu ergeben sich für die MALS-Signale, welche die Molmasse anzeigen, nahezu deckungsgleiche Daten für sämtliche Läufe. Dies bedeutet, dass die ermittelte Molmasse in allen Fällen genau gleich war.

Evaluierung der Daten

Als mittlere Molmasse des Antikörpers wurden 153.650 Da gemessen. Die Standardabweichung um den Mittelwert ist mit 1,7 % sehr klein. Daraus ergibt sich, dass die Molmasse über einen extrem weiten Konzentrationsbereich hinweg sehr exakt bestimmt werden konnte. Die eingesetzte Menge variierte hierbei um den Faktor 2500 und erbrachte dennoch praktisch identische Messwerte, wie in Bild 2 deutlich wird. Für die Analyse von Antikörpern ist die hohe Konstanz der Messung ausgesprochen vorteilhaft. Denn einerseits steht für die Messung häufig nur eine sehr geringe Menge wertvoller Probe zur Verfügung, so dass eine hohe Empfindlichkeit erforderlich ist. Auf der anderen Seite sind die Stoffkonzentrationen in den fertigen therapeutischen Präparaten oftmals recht hoch, so dass beispielsweise für die Qualitätskontrolle eine Methode benötigt wird, die auch für hochkonzentrierte Lösungen ebenso exakte wie reproduzierbare Daten liefert.

Die gezeigten Messungen machen deutlich, dass die hier eingesetzten Detektoren Wyatt Dawn Heleos (MALS) und Optilab (RI) in Kombination mit dem Agilent 1260 Infinity Bio-inert LC-System ein äußerst effizientes instrumentelles Gesamtsystem bilden. Mit diesem Ansatz lassen sich über einen weiten Protein-Konzentrationsbereich hinweg sehr gut reproduzierbare Ergebnisse erzielen. Daher kann man solch eine Instrumentierung als Methode der Wahl zur Analyse therapeutischer Proteine in vielfältigen Anwendungsbereichen ansehen.

*) Wyatt Technology Europe GmbH, Hochstraße 18, 56307 Dernbach, thomas.jocks@wyatt.eu, http://www.wyatt.eu

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