AF4 in einem neu entwickelten Frit-Inlet-Kanal (FI-AF4)

Auftrennung von Hyaluronsäure

In diesem Beitrag zeigen wir, wie sich mit Hilfe eines sogenannten Frit-Inlet-Kanals die Separation von Hyaluronsäure auch bei schwierigen Proben gut bewerkstelligen lässt. Dies kann dazu beitragen, dass die AF4 als Trennmethode insgesamt einem noch größeren Anwenderkreis zugänglich gemacht wird.

Hyaluronsäure (HA) ist ein natürlich vorkommendes lineares Polysaccharid, das aus D-Glucuronsäure und N-Acetyl-D-Glucosamin besteht. Sein Molekulargewicht liegt zwischen 105 und 107 Da. Im menschlichen Körper findet man HA hauptsächlich in Bindegewebe und in der Synovialflüssigkeit von Gelenken, wo diese Verbindung schockabsorbierend und als „Schmiermittel“ wirkt. Diese viskoelastischen Eigenschaften, zusammen mit seiner guten Anwendungsverträglichkeit, trugen dazu bei, dass HA inzwischen in vielen biomedizinischen und pharmakologischen Bereichen eingesetzt wird.

Die Hyaluronsäure-Spezies, die in dieser Untersuchung verwendet wird, entstammt einer bakteriellen Fermentierung durch das Bakterium Bacillus subtilis bei Novozymes A/S. Es ist allgemein als biologisch sicheres Agens eingestuft (durch die Bezeichnung GRAS – Generally Recognized As Safe, US Food and Drug Administration, FDA). Damit diese Einstufung gewährleistet wird, bedarf es eines speziellen Herstellungsprozesses, bei dem Minimalmedien, tierfreie Ausgangsstoffe und eine Reinstwasser-basierte Vorgehensweise ohne organische Lösemittel zum Einsatz kommen.

Anzeige
Bild 1: Die SEC-Trennung von zwölf HA-Proben zwischen 7 kDa und 2,8 MDa ist gezeigt. Die Trennung der Komponenten mit hoher Molmasse ist deutlich schlechter als die der kleineren Bestandteile und zeigt eine atypische Kurve.

GPC/SEC nicht immer geeignet
Die physikalischen Eigenschaften von HA beruhen hauptsächlich auf dem Molekulargewicht der Polysaccharide und der Verteilung der Molmassen. Deshalb sind die analytischen Werkzeuge von großer Bedeutung, mit denen man diese Parameter bestimmt. Traditionell ist die Größenausschluss-Chromatographie (SEC/GPC) die hauptsächlich angewandte Methode, mit der man bislang Molekulargewichte und deren Verteilung bei Hyaluronsäure ermittelt hat. Nun ist es allerdings so, dass die SEC oftmals nicht optimal geeignet ist für die zu messenden hohen Molekulargewichte. Die maximalen Porengrößen der verfügbaren Säulenmaterialien sind häufig nicht groß genug. Starke Scherkräfte führen in der Folge zur Degradation der großen Moleküle, manchmal kommt es auch zur Verstopfung der Säulen. Auch sind meist keine verlässlich anwendbaren Größenstandards verfügbar, was natürlich bei der Kalibrierung für die entsprechenden Schwierigkeiten sorgt.

Tabelle 1: Bei der Auftrennung einer hochmolekularen HA-Probe mit Standard-AF4-Methode (konventionelle Fokussierung) kommt es zur Bildung von Aggregaten.

Hier bot sich bereits früh die Asymmetrische Fluss-Feldflussfraktionierung (AF4) als alternative Trennmethode an, und zwar gekoppelt an Mehrwinkel-Lichtstreuungsmessung (MALS, Multi Angle Light Scattering) zur Bestimmung des Molekulargewichtes sowie Konzentrationsbestimmung mittels RI-Detektor. Doch auch hier gab es nicht immer optimale Resultate. Die konventionelle Form der AF4 mit dem normalen Trennkanal erwies sich als anfällig für die Bildung von Aggregaten. Dies zeigte sich speziell im Fokussierungsschritt, bei dem die Moleküle in relativ hoher Konzentration in einem kleinen Areal des Kanals vorliegen. Durch solche Artefakte erhöht sich natürlich das gemessene Molekulargewicht. Doch es gibt für dieses Problem eine Lösung: den Einsatz eines sogenannten Frit-Inlet-Kanals (FI-Kanal).

Bild 2A: Das Funktionsprinzip des FI-AF4-Kanals.

Funktionsweise des FI-Kanals
Bei der FI-AF4 wird ein Trennkanal benutzt, dessen Konstruktion etwas von der eines Standard-Kanals abweicht. Der FI-Kanal besitzt eine zusätzliche Einlassfritte, durch die mittels der entstehenden Hydrodynamik eine Relaxierung der Probe ermöglicht wird. Das Probenmaterial wird langsam durch die Einlassöffnung in den Kanal transportiert. Hier wird die Probe durch den Fluss aus der Einlassfritte in Richtung der Membran gedrückt, während sie sich gleichzeitig im Kanal weiter bewegt. Der Fluss im Kanal wird also nicht angehalten wie bei der Fokussierung im Standard-Kanal. Durch diesen kontinuierlichen Fluss verringert sich deutlich die Gefahr von Adhäsion und Aggregation der Probenbestandteile. Bild 2A verdeutlicht dieses Funktionsprinzip.

Material und Methode
Für die Größen-Ausschluss-Chromatographie wurden eine Pumpe Waters Alliance und ein Auto-Sampler eingesetzt, zur Detektion ein Wyatt Technology Dawn Eos und ein Optilab rEX. Die Säulen TSK Gel G5000PWXL mit 150 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4, 0,05 % NaN3 bei pH 7,0 als mobiler Phase. Die AF4-Anlage bestand aus Agilent 1200 Pumpe und Auto-Sampler sowie einem Wyatt Dawn Heleos II mit Qels (DLS) und Optilab T-rEX; AF4-Gerät: Wyatt Eclipse 3+ mit LC-Kanal und 350-µm-Spacer.

Bild 3: Molekulargewicht gegen Elutionszeit bei unterschiedlicher Probenbeladung. Bei hoher Beladung zeigt sich eine Zunahme des Molekulargewichts und eine Verschiebung des Lichtstreusignals hin zu höheren Elutionszeiten.

FI-AF4-Instrumente: Agilent 1200 Pumpe, Auto-Sampler, Wyatt Dawn Heleos II mit Qels (DLS) und Optilab T-rEX; AF4: Wyatt Eclipse 3+ mit einem vom LC abgeleiteten Frit-Inlet-Kanal mit 350-µm-Spacer. Die Injektions-Flussrate betrug 0,2 ml/min. Die Trennmethode ist in Bild 2B dargestellt.

Ergebnisse der Standard-AF4-Methode (mit Fokussierung)
In Bild 3 ist das Resultat der Auftrennung einer hochmolekularen HA-Probe dargestellt, bei der die konventionelle Fokussierung angewandt wurde. Die experimentellen Bedingungen wurden konstant gehalten, die Probenbeladung aber erhöht. Im Zuge dieser Erhöhung wird eine Verschiebung des 90°-Lichtstreusignals erkennbar. Außerdem vergrößert sich die Aggregatfraktion in der Probe. Dieser Effekt macht klar, dass die konventionelle AF4 für die Charakterisierung von HA nicht optimal geeignet ist, da sie offenbar die Bildung von Aggregaten begünstigt.

Dr. Thomas Jocks, Wyatt Technology Europe GmbH

Ergebnisse mit der Frit-Inlet-Methode
Dass diese Vorgehensweise bei der Trennung von HA gute Ergebnisse liefern kann, wurde bereits berichtet [1]. Hier zeigen wir Vergleichsdaten von Proben, die bereits zuvor mittels SEC und konventioneller AF4 analysiert worden waren. Wie aus Bild 4 hervorgeht, ermöglicht die FI-AF4 eine effiziente Trennung der Probe, ohne dass vermehrt Aggregation stattfindet.

Dennoch ist die Separation von HA nach wie vor eine anspruchsvolle Aufgabe. Die Probe eluiert in einem breiten Peak mit starker Verdünnung und entsprechend schwächerem Detektorsignal. Dies ist vor allem ein Problem für den Konzentrationsdetektor, der mithilfe von Refraktionsdaten arbeiten muss, da HA nicht UV-aktiv ist. Daher ist es sinnvoll, den Querfluss bei der Elution zu reduzieren, und zwar in diesem Fall in exponentieller Weise. Die dabei entstehende leichte Drift kann durch die Wahl einer speziellen Membran minimiert werden. Das verwendete Optilab rEX RI-Gerät trägt durch seine hohe Empfindlichkeit wesentlich zum Gelingen der Messung bei.

Dr. Anne Marie Scharff-Poulsen, Novozymes A/S, Biopharma Application Development

Schlussfolgerung und Ausblick
Die Frit-Inlet-Technologie ist eine vielversprechende Methodik zur Auftrennung von Proben, die stark zur Aggregation neigen. Sie ist daher eine sehr nützliche Erweiterung des analytischen Werkzeugkastens, indem sie ein methodisches Problem der AF4 löst. Zwar gibt es geringe Einbußen bei der Auflösung, aber dafür ist die Anwendung einfacher und sehr robust. Die Stabilität der Basislinie verbessert sich ebenfalls.

Literatur
[1]
Moon, MH, J. Sep. Sci., 2010, 33, 3519-3529 (review on HA analysis).
[2] D. Shin, E. Hwang, I. Cho, M. H. Moon, J. Chromatography A. 2007, 1160 , 270-275.
[3] Takahashi R, Al-Assaf S, Williams PA, Kubota K, Okamoto A, Nishinari K(2003) Biomacromol. 4: 404-409.
[4] Kang D Y, Kim W-S, Heo I S, Park Y H, Lee S (2010) J. Sep. Sci. 33: 3530-3536.
[5] Moon, M.H.; Kwon, H.S.; Park, I. Anal. Chem. 1997, 69, 1436-1440 (Introduction to FI-AF4).

Autoren:
Dr. Thomas Jocks
Wyatt Technology Europe GmbH
Hochstraße 18
56307 Dernbach
thomas.jocks@wyatt.EU

Dr. Anne Marie Scharff-Poulsen
Novozymes A/S,
Biopharma Application Development
Bagsvaerd, Denmark.

Anzeige

Das könnte Sie auch interessieren

Anzeige

Polymeranalytik

Gold-Nanopartikel

Charakterisierung in komplexer biologischer Matrix Der zunehmende Einsatz von Nanopartikeln wirft Fragen und Probleme auf. So müssen unter anderem Risiken für die Umwelt durch emittierte Partikel eingeschätzt werden oder mögliche gesundheitliche...

mehr...
Anzeige

Integriertes Datenmanagement

Ihre im Labor erzeugten Daten können Sie sicher und strukturiert in einem System sammeln. NEC und labfolder bieten ein Mittel für die effiziente Verwaltung großer wissenschaftlicher Datensätze an.

mehr...

Polymeranalytik

Anwendung von AF4-MALLS

Dendritische (verzweigte) Polymere genießen ein stetig steigendes wissenschaftliches Interesse. Dies ist vor allem ihren breit gefächerten Eigenschaften zuzuschreiben, die bedarfsgerecht gestaltet werden können. Speziell gilt das für die Klasse der...

mehr...
Anzeige
Anzeige

Highlight der Woche

Integriertes Datenmanagement
Die Herausforderung bei der Digitalisierung des Laboralltags besteht im Wechsel von Papierlaborbüchern und Computerdateien zu einer Datenmanagementsoftware, die große Datensätze strukturiert innerhalb eines einzigen Systems sammelt.

Zum Highlight der Woche...