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Kohlenstoffpartikel. © Merck

Poröser graphitischer Kohlenstoff (Porous Graphitic Carbon, PGC) bietet besondere Retentionsmechanismen, die über die Möglichkeiten von üblichen Umkehrphasenmaterialien hinausgehen. Die Annahme, dass sich ein Träger, der vollständig aus Kohlenstoffatomen besteht, wie eine „perfekte“ unpolare Phase ohne aktive Silanolgruppen verhalten würde, bildete die Grundlage für die Entwicklung des PGC. Weitere Untersuchungen zeigten jedoch, dass dies nicht der Fall war. Es stellte sich heraus, dass sich die Retentionseigenschaften von PGC von denen herkömmlicher unpolarer Phasen unterscheiden. Studien von Möckel [1], Tanaka [2] und Ross [3] zeigten verschiedene Eigenschaften beim Vergleich von PGC mit ODS (C18)-Phasen. Zusammengefasst:

Tabelle 1: Chromatographische Bedingungen für die Trennung von polaren anionischen Pestiziden auf Supel™ Carbon LC (Bild 1). Quelle: Merck KGaA

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Trennung von Vitamin-D- Metaboliten und ihren Epimeren

Bild 2: Strukturen von 25-Hydroxyvitamin D2 und D3 und ihrer jeweiligen Epimere. © Merck

Eine weitere Anwendung, die die Vorteile von PGC-Materialien unterstreicht, ist die Fähigkeit, geometrische Isomere, wie z. B. Vitamin-D-Metaboliten und deren Epimere, zu trennen. Vitamin-D-Metaboliten werden als Biomarker für mögliche Krankheitszustände und Vitaminmangel verwendet. Der Test basiert auf dem Spiegel von zwei Metaboliten im Blut: 25-Hydroxyvitamin D2 und D3. Es wurde festgestellt, dass diese Biomarker durch einen C3-Epimerisierungsweg epimerisiert werden können, was zu zwei weiteren Formen von Metaboliten führt, C3-epi-25-Hydroxyvitamin D2 und D3 (Bild 2); [4]. In letzter Zeit wurde diskutiert, ob diese Epimere die gleiche biologische Funktion haben wie die Ursprungsverbindungen. Daher ist es notwendig, den Anteil der Epimere unter den Metaboliten mit LC-MS zu bestimmen.

Bild 3: Trennung von 25-Hydroxyvitamin D2 und D3 und deren Epimeren auf SupelTM Carbon LC. Es werden gute Peakformen und Empfindlichkeit erreicht. (Chromatographische Bedingungen s. Tabelle 2.) Elutionsreihenfolge: 1) 3-epi-25-(OH)-D3: 8,294 min; 2) 25-(OH)-D3: 9,125 min; 3) 3-epi-25-(OH)-D2: 11,126 min; 4) 25-(OH)-D2: 12,062 min © Merck

Da die Epimere das gleiche m/z-Verhältnis aufweisen, ist es notwendig, diese vor der MS-Detektion chromatographisch zu trennen [4, 5]. PGC hat sich hier als effektiv erwiesen, um sowohl die Vitamin-D2- und -D3-Metaboliten als auch die Epimer-Analoga aufzutrennen.

Tabelle 2: Chromatographische Bedingungen für die Trennung von 25-Hydroxyvitamin D2 und D3 und der jeweiligen Epimere (zu Bild 3). Quelle: Merck

Unter Verwendung eines einfachen Gradienten mit starken organischen mobilen Phasen können so alle vier Verbindungen in einer angemessenen Analysezeit basisliniengetrennt werden (Bild 3).

Zusammenfassung

Poröser graphitischer Kohlenstoff (PGC) ist eine alternative stationäre Phase, die zusätzliche Optionen zur Trennung anspruchsvoller Verbindungen bietet, die über den Bereich der konventionellen Umkehrphasen-Chromatographie auf Kieselgel-basis hinausgehen. Während sich die Säule in vielerlei Hinsicht wie eine Umkehrphasen-Säule verhält, bietet PGC die Vorteile einer erhöhten Temperatur- (bis 250 °C), Lösungsmittel- und pH-Stabilität (pH 1 – 14). Zudem können aufgrund der einzigartigen Eigenschaften von graphitischem Kohlenstoff hochpolare Verbindungen, die ansons-ten HILIC- oder Ionenaustauschbedingungen benötigen, auf einer PGC-Säule retardiert werden. Obwohl die Retentionsmechanismen noch nicht vollständig geklärt sind, ist offensichtlich, dass PGC besonders gute Retentions-Eigenschaften gegenüber polaren Verbindungen besitzt – insbesondere gegenüber planaren Molekülen oder Analyten mit konjugierten Doppelbindungen, die mit der Elektronenwolke von Graphit interagieren können. PGC ist damit eine einzigartige stationäre Phase unter den konventionellen stationären HPLC-Phasen, und zukünftige Forschung zu den PGC-Partikeln könnten deren Anwendungsgebiet noch erweitern.

Literatur:

[1] H. J. Möckel, A. Braedikow, H. Melzer & Gaby Aced, A Comparison of the Retention of Homologous Series and Other Test Solutes on an ODS Column and a Hypercarb Carbon Column, Journal of Liquid Chromatography, 1991, 14:13, 2477-2498

[2] Nobou Tanaka, Tetsuya Tanigawa, Kazuhiro Kimata, Ken Hosoya, Takeo Arai, Selectivity of carbon packing materials in comparison with octadecylsilyl- and pyrenylethylsilylsilica gels in reversed-phase liquid chromatography, Journal of Chromatography, A, 1991, Volume 549, 29-41

[3] Knox, J. and Ross, P. Advances in Chromatography, 1997, 37, 73-119

[4] Shah, I., James, R., Barker, J. et al. Misleading measures in Vitamin D analysis: A novel LC-MS/MS assay to account for epimers and isobars. Nutr J, 2011, 10, 46 https://doi.org/10.1186/1475-2891-10-46

[5] Karras, S. N., Kotsa, K., Angeloudi, E., Zebekakis, P., & Naughton, D. P. The Road Not So Travelled: Should Measurement of Vitamin D Epimers during Pregnancy Affect Our Clinical Decisions?. Nutrients, 2017, 9 (2), 90. https://doi.org/10.3390/nu9020090

AUTOREN
Clinton Corman, Cory Muraco, William Maule, Michael Ye
Merck KGaA, Darmstadt
SigmaAldrich.com/carbonLC