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Biologische Proben in 3D - Lichtscheiben-Fluoreszenzmikroskopie

Chemie und Struktur im BildKorrelative, konfokale Raman-Mikroskopie von Organismen und Biomolekülen

Topographisches Raman-Bild der Oberfläche einer Schmerztablette mit zugehörigen Spektren

Die Raman-Mikroskopie lässt sich in vielen Bereichen einsetzen und etabliert sich jetzt auch mehr und mehr in den Lebenswissenschaften und in der Pharmazie.

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Lichtscheiben-FluoreszenzmikroskopieBiologische Proben in 3D

Die Lichtscheiben-Fluoreszenzmikroskopie revolutioniert aktuell die Beobachtung und Analyse dreidimensionaler biologischer Proben. Zusammen mit dreidimensionalen Zellkulturen erweitert sie den quantitativen Raum auf mehreren Skalen.

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mDSLM-Kammer

Um Leben in seiner Gesamtheit zu verstehen, muss man die Komplexität zellulärer Prozesse aufklären, die dynamisch und entlang aller räumlichen Dimensionen ablaufen. Moderne lichtmikroskopische Verfahren gewähren einen detaillierten Einblick in die biologischen Prozesse, die sich auf unterschiedlichen Skalen eines Organismus oder eines Gewebes abspielen. Dabei können zeitgleich Veränderungen von (1) subzellulären Strukturen, z.B. von Organellen, (2) zellulären Strukturen, z.B. von Positionen einzelner Zellen, aber auch (3) globale Veränderungen des gesamten Gewebes, z.B. sein Volumen, beobachtet werden [1]. Für diesen Ansatz sind ort- und zeitaufgelöste optische Verfahren unabdingbar. Änderungen dreidimensionaler biologischer Proben werden als Funktion der Zeit erfasst. 

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Das Ziel der Systembiologie ist, die Komplexität räumlicher Strukturen und dynamischer Prozesse eines biologischen Systems mehrskalig in ein mathematisch-physikalisches Modell zu übertragen und zu modellieren. Um dieses Ziel zu erreichen, ist es notwendig, Proteine und Lipide spezifisch und mit sehr hohem Kontrast zu visualisieren. Dies gelingt unter Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen, fluoreszierenden Antikörpern oder über die Expression fluoreszierender Proteine. Um die Positionen der Fluorophore in dreidimensionalen, vielschichtigen Proben abzubilden, sind hochentwickelte Mikroskopietechniken erforderlich [2]. Diese ermöglichen selektiv, einzelne Ebenen innerhalb einer Probe zu erfassen, ohne die Probe mechanisch zu zerkleinern.

Separate optische Pfade bei der LSFM
Das Verfahren, bei der eine hohe Schärfentiefe benötigt wird, nennt man optisches Schneiden (engl. optical sectioning). Hier hat sich neben der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie (engl. confocal fluorescence microscopy, CFM), besonders die Lichtscheiben-Fluoreszenzmikroskopie (LSFM) bewährt. Letztere revolutioniert aktuell die Beobachtung und Analyse dreidimensionaler biologischer Proben. Im Gegensatz zu älteren Techniken liegen die wesentlichen Unterschiede (1) im Aufbau des optischen Pfads, (2) in der Beleuchtungsart der Probe und (3) in der Positionierung der Probe im Probenraum des Mikroskops [3].

Prinzipieller Aufbau eines Lichtscheibenmikroskops

Im Unterschied zur CFM sind bei der LSFM Anregung und Detektion durch separate optische Pfade voneinander unabhängig. Detektions- und Anregungsobjekiv sind rechtwinklig zueinander angeordnet (Bild 1). Die Illumination der Probe erfolgt nicht, wie bei der CFM, punktweise durch einen fokussierten Laser, sondern bildweise durch eine Lichtscheibe. Diese wird entweder durch eine zylindrische Linse (statische Lichtscheibe, SPIM) oder einen Rasterspiegel (dynamische Lichtscheibe, DSLM) erzeugt. Über das Anregungsobjektiv wird die Lichtscheibe in die Fokusebene des Detektionsobjektivs gelegt. Die orthogonale Orientierung der Objektive sowie die Beleuchtung der Probe mittels einer dünnen Lichtscheibe bewirken, dass nur Fluorophore, die sich in der Fokusebene befinden, angeregt werden, während Fluorophore anderer Ebenen nicht beleuchtet werden. Im Gegensatz dazu wird bei der CFM für jede einzelne Ebene jeweils die gesamte Probe beleuchtet. Die Detektion von Fluoreszenzlicht außerhalb der Fokusebene wird hier durch eine Lochblende verhindert. Somit findet das optische Schneiden bei der LSFM bereits im Beleuchtungspfad und bei der CFM erst im Detektionspfad statt.

Probenpositionierung reduziert Bleichen der Fluorophore
Darüber hinaus ist auch die Probenpositionierung bei der LSFM eine andere als in klassischen Mikroskopietechniken. In der LSFM kann die Probe im rechten Winkel zwischen die beiden Objektive in eine mit Flüssigkeit gefüllte Probenkammer platziert werden. Dies ermöglicht zum einen die Verwendung von Wasserimmersionsobjektiven und erlaubt zum anderen, die Probe um eine parallel zur Gravitation ausgerichteten Achse zu drehen. Die Probe kann somit systematisch aus unterschiedlichen Richtungen betrachtet werden. Aufgrund der besonderen Bauweise des LSFM kann die Probe während der Aufnahme mit einer 100- bis 10 000-fach geringeren Anregungslichtenergie bestrahlt werden als in einem CFM [3]. Dadurch wird das Bleichen von Fluorophoren massiv und nachhaltig reduziert. Dies ist insbesondere bei der Mikroskopie von lebenden Proben unabdingbar, da die Probe effektiv vor Phototoxizität geschützt wird. 

LSFM und dreidimensionale Zellkulturen erweitern quantitativen Raum auf mehreren Skalen
Die Erforschung komplexer multizellulärer Prozesse und ihrer zugrundeliegenden Mechanismen bedarf dreidimensionaler biologischer Modelle, die In-vivo-Bedingungen eher widerspiegeln als klassische Zellkulturen. Die Expression bestimmter Gene, die beispielsweise mit Gewebeentwicklung, Zelladhäsion, Stressreaktion und Pathogenese assoziiert sind, variiert mitunter deutlich zwischen flachen Zellkulturen und multizellulären In-vitro-Modellsystemen wie Zysten, Organoiden und Sphäroiden.

Lichtscheiben-Fluoreszenzmikroskopie: Biologische Proben in 3D

Mithilfe der LSFM ist es nun möglich, umfangreiche quantitative Informationen über eine dreidimensionale Probe zu sammeln und mehrskalig, d.h. auf verschiedenen räumlichen und zeitlichen Ebenen, zu analysieren (Bild 2). Zunächst werden Daten auf subzellulärem und zellulärem Niveau generiert. Einzelne Zellen werden durch eine Vielzahl unterschiedlicher Parameter charakterisiert, bevor die Probe durch die Auswertung übergeordneter Eigenschaften wie der globalen und lokalen Zellkerndichte, dem Gesamtvolumen und der geometrischen Form auf multizellulärer Ebene beschrieben werden kann. So erhält man durch die Quantifizierung verschiedener Ebenen der Probe einen Einblick in immer komplexere Strukturen.

Sicherlich kann die dreidimensionale Zellbiologie derzeit noch keine Tierversuche oder Experimente an klinischen Proben ersetzen, jedoch überbrückt sie jetzt schon die Kluft zwischen zweidimensionalen Zellkulturen und In-vivo-Modellen [4]. Aus einer Brustkrebszelllinie (T47D) formierte Sphäroide bilden beispielsweise polarisierte Strukturen (Azini), die dem histologischen Muster von luminalem Brustkrebsgewebe sehr ähneln. Die Bedeutung dieser Beobachtung wird zudem durch das molekulare Profil dieser Zellen unterstrichen. Basierend auf der Verteilung der Zellkerne, der Anordnung der Zellmembranen und der Abwesenheit des Golgi-Apparates, können die Anzahl der Azini sowie deren Volumen und Form berechnet werden [5] (Bild 2). Mit diesen Daten können, in Kombination mit übergeordneten Informationen, die aus der quantitativen Zellkern-Segmentierung abgeleitet sind, morphologische Merkmale im Detail beschrieben werden. Dies schließt die relative Lokalisierung und Verteilung der Azini innerhalb des Sphäroids, z.B. abhängig von ihrer Entfernung zur Oberfläche, ein. Diese Werte können im Anschluss mit Daten verglichen werden, die aus Brusttumor-Xenotransplantaten oder klinischen Proben stammen. Veränderungen von Parametern wie Azini-Bildung, Tumorwachstum, Zellkerngröße und Zellzusammenhalt können ermittelt werden, um die Auswirkungen von potenziellen Chemotherapeutika zu beurteilen. LSFM ist die bislang beste Methode für Untersuchungen dieser Art.

Im Zentrum des Mikroskops: die Probe
Die Effizienz und Präzision von Nachbearbeitungsalgorithmen für die Segmentierung und Quantifizierung hängen stark von der Aufnahmequalität und somit der Probenpräparation ab. Die Bildqualität wird vor allem durch die Dicke der Probe, die Dichte des Gewebes und variierende Brechungsindices innerhalb der zellulären Struktur beeinflusst. Abhängig von der biologischen Fragestellung und Art der Probe bieten sich außerdem unterschiedliche Probenhalter an. Die Architektur des LSFM ermöglicht, dass die Probe im Mittelpunkt steht und das Mikroskop „um diese herum“ gebaut wird, um die naturgemäße Integrität der Probe zu erhalten. Neben der klassischen Probenpräparation innerhalb eines gasdurchlässigen Gelbildners (z.B. Agarose), bieten sich in anderen Anwendungen quadratische Glaskapillaren (für optisch aufgehellte Proben) oder aus Agarose gegossene Becher an, in denen sich die Zellen in Suspension befinden.

Pankreasorganoiden

Streueffekte können durch eine optische Aufhellung der Probe deutlich reduziert werden. Optische Aufhellung beruht auf dem Prinzip des Austauschs des in der Probe enthaltenen Wassers durch für die Aufhellung des Gewebes geeignete Lösungen mit angepasstem Brechungsindex. Daher ist die optische Aufhellung nur für Endpunktaufnahmen fixierter Proben geeignet. Die Aufhellung führt zu einem deutlich gesteigerten Kontrast, einer signifikanten Erhöhung der Eindringtiefe und einer verbesserten Auflösung interner Strukturen. Zusätzlich bzw. alternativ ermöglicht der Rotationsfreiheitsgrad des LSFM die Aufnahme von lebenden Proben aus mehreren Richtungen (engl. multiple views). Die generierten Bilddaten der verschiedenen Ansichten werden über ein Bildbearbeitungsprogramm zu einer einzigen Bilddatei fusioniert, um die wie zuvor für die optische Aufhellung beschriebene Verbesserung der Bildqualität zu erreichen (Bild 3). Umfangreiche Bildstapel entstehen vor allem bei der Aufnahme lebender Proben aus mehreren Richtungen. Die großen Datenmengen, die gesammelt werden müssen, bedürfen für ihre Auswertung einer ausgereiften Infrastruktur. 

Moderne Bildverarbeitungsstränge für große Datenmengen
Die Herausforderung der Datenanalyse besteht darin, große, multidimensionale Datensätze zu visualisieren und quantitative Aussagen zu generieren. Die Leistung des Rechensystems kann leicht an laborübliche Grenzen stoßen. Glücklicherweise schreitet die Entwicklung leistungsfähiger Systeme für die Datenverarbeitung stetig voran. Schnelle, mehrkernige Prozessoren, große Arbeits- und Festplattenspeicher, schnelle Speicher und die Möglichkeit, auf massiv parallel arbeitenden Grafikkarten zu rechnen, gehören heute zum Standard vieler Arbeitsgruppen und ermöglichen es, viele Terabyte große Datensätze zu verarbeiten. Computercluster sind zudem häufig arbeitsgruppenübergreifend vorhanden und inzwischen deutlich leichter zu nutzen als noch vor wenigen Jahren.

Für die Visualisierung existieren zahlreiche kommerzielle, hochspezialisierte Programme, die es erlauben, Terabyte große 3D-Datensätze als Funktion der Zeit darzustellen. Damit ist es möglich, einen fundierten Einblick in die Daten zu bekommen, aber auch, sie Nichtexperten leichter zugänglich zu machen. Außerdem existieren mittlerweile frei verfügbare Bildverarbeitungsprogramme, wie Fiji (ImageJ), Icy, Cell Profiler oder Ilastik. Diese bieten verschiedene Basisfunktionen, aber auch spezialisierte Erweiterungen für einige der gängigsten Verarbeitungsschritte an.

Sofern die Bildverarbeitung in eine Analysenfolge eingebettet werden soll, bedarf es jedoch meist umfangreicherer Programme. Hier bieten kommerzielle Plattformen wie Mathematica oder Matlab Möglichkeiten für die Bildverarbeitung und Funktionen für die weiterführende statistische Auswertung und Analyse. 

Systematische Datenerfassung: LSFM ebnet Weg
Aktuell profitiert die Mikroskopie stark von der Entwicklung größerer und schnellerer Kameras. Außerdem erfordern die zahlreichen Anwendungsmöglichkeiten der LSFM die stetige Neu- und Weiterentwicklung von Algorithmen und Programmen für die Bildverarbeitung. Bisher dient die Aufnahme der Bilddaten meist einer bestimmten biologischen Fragestellung. Der Umfang der gesammelten Daten bietet jedoch weitaus mehr extrahierbare Informationen, die derzeit meist noch ungenutzt bleiben. Der Trend sollte demnach weg von „on-demand“-Aufnahmen hin zur systematischen Datenerfassung und zur Etablierung weitreichender Datenbanken gehen. Diese Datenbanken können im Rahmen der „open access“-Initiativen einem breiten Publikum zur Verfügung gestellt werden, um den globalen Austausch von Daten zu fördern. Forscher anderer Arbeitsgruppen können Informationen aus den umfangreichen Datensätzen für ihre Zwecke extrahieren und nutzen. Somit kann Redundanz innerhalb eines Forschungsfeldes reduziert und das Kollaborationspotenzial sowie die Interdisziplinarität innerhalb der Forschungsgemeinde gefördert werden. 

Literatur
[1] Schmitz, A., Fischer, S. C., Mattheyer, C., Pampaloni, F. & Stelzer, E. H. K. Multiscale image analysis reveals structural heterogeneity of the cell microenvironment in homotypic spheroids. Sci. Rep. 7, 43693 (2017).

[2] Smyrek, I., Stelzer, E. H. K. Quantitative three-dimensional evaluation of immunofluorescence staining for large whole mount spheroids with light sheet microscopy. Biomed. Opt. Express 8, 484–499 (2017).
[3] Stelzer, E. H. K. Light sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nat. Methods 12, 23–26 (2015).
[4] Pampaloni, F., Reynaud, E. G. & Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 839–845 (2007).
[5] Strobl, F., Schmitz, A. & Stelzer, E. H. K. Improving your four-dimensional image: traveling through a decade of light-sheet-based fluorescence microscopy research. Nat. Protoc. 12, 1103–1109 (2017).

Autoren:

Katharina Hötte, Michael Koch, Lotta Hof, Ernst H. K. Stelzer

Physical Biology/Physikalische Biologie Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS), Cluster of Excellence Frankfurt–Macromolecular Complexes (CEF–MC) Goethe Universität Frankfurt am Main (Campus Riedberg)
http://www.physikalischebiologie.de

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