Proteine trennen für die Massenspektroskopie

Aus einfachem Abschätzen wird vielfaches Messen

Die zweidimensionale Kapillarelektrophorese ermöglicht die Online-Charakterisierung von gelelektrophoretisch getrennten Proteinen mittels Massenspektrometrie. Diese Methode beschreiben Autoren in ihrem Artikel für LABO.

Die Gelelektrophorese zur Trennung von Proteinen nach deren Größe wurde bereits vor 50 Jahren eingeführt [1] und hat sich zu der am weitesten verbreiteten Trenntechnik ihrer Art entwickelt. Dabei wird zu dem zu analysierenden Protein bzw. Proteingemisch Natriumdodecylsulfat (engl. Sodium dodecyl sulfate (SDS)), hinzugegeben, das mit den Proteinen einen Komplex bildet. Die resultierende negative Ladung des SDS-Protein-Komplexes überdeckt die Eigenladung des Proteins und ist proportional zu der Größe des Proteins. Dadurch werden die Komplexe bei ähnlichen Ladungs-zu-Masse-Verhältnissen theoretisch nur anhand ihrer Größe in einem elektrischen Feld durch ein Trenngel, meist ein Polyacrylamidgel (PAGE), getrennt. Durch den Vergleich der Migration der zu analysierenden Proteine mit der Migration von Proteinen mit bekannten Massen kann durch Extrapolation die unbekannte Masse abgeschätzt werden. SDS-PAGE dient somit zur Bestimmung von Proteinmassen und zur Trennung komplexer Proteingemische anhand ihrer Größe.

Aufgrund des relativ hohen Labor- und Zeitaufwands wurde diese Analysetechnik dahingehend optimiert, dass die Trennung nicht mehr in einem Trennbett, sondern in einer Quarzglaskapillare (CE(SDS)) stattfindet. Diese Kapillare besitzt einen Innendurchmesser von meist 50 µm und wird mit einem Trenngelpuffer gefüllt. Dieser unterscheidet sich von dem bei der SDS-PAGE herkömmlich verwendeten Trenngel dahingehend, dass wasserlösliche lineare oder nur leicht vernetzte Polymere verwendet werden (anstatt quervernetzter Polymere), um den Trenngelpuffer in der Kapillare austauschen zu können [2]. Somit wird die Trennung in der Kapillare automatisierbar und die Reproduzierbarkeit wird erhöht. Ein weiterer wesentlicher Vorteil der Trennung in der Kapillare stellt die Online-Detektion durch UV-Absorption oder Fluoreszenz dar. Dadurch ist es möglich, quantitative Aussagen zu treffen, und die aufwändige Fixierung und das Anfärben der getrennten Proteine wie bei SDS-PAGE werden hinfällig.

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Aufbau und Messablauf des CE(SDS)-CZE-MS Systems. a Detailliertes Schema der Position A des Nanoliter-Ventils, bei der die Trennung des reduzierten Antikörpers (mAb) in der ersten CE(SDS)-Dimension stattfindet. Während dessen findet die Positionierung des Methanols (rot) und des kationischen Tensids CTAB (blau) für die SDS-Protein-Dekomplexierung in der zweiten Dimension statt. b CE(SDS)-UV Trennung des reduzierten Antikörpers in der ersten Dimension. c Detailliertes Schema der Position B des Nanoliter-Ventils, bei der der Analytpeak, der von Interesse ist, in die zweite Dimension zwischen dem Methanol und dem kationischen Tensid positioniert wird d Base Peak Elektropherogramm (BPE), das die Trennung vom Analytpeak von den Störsubstanzen des Trenngelpuffers und das dazugehörige Massenspektrum in der zweiten CZE-MS Dimension zeigt. © Springer

Eine breite Anwendung findet CE(SDS) in der biopharmazeutischen Industrie, um die Reinheit und die Abbauprodukte therapeutischer Proteine wie Antikörpern zu prüfen bzw. zu charakterisieren. Schwerpunkt der Analyse ist deshalb die Trennung und Quantifizierung von entstehenden Fragmenten. Die Identifikation dieser Fragmente ist ein weiterer wichtiger Punkt, da diese sich auf die Wirksamkeit des therapeutischen Proteins auswirken können und damit auf die Sicherheit der Patienten.

Ungenaue Massenbestimmung durch Extrapolation

Die Identifizierung erweist sich als enorme Herausforderung. Da die Trennleistung von CE(SDS) oft nicht ausreichend ist, kann es dazu führen, dass sich hinter einem Peak mehrere Fragmente verbergen. Dadurch wird die Zuordnung von Peaks zu Fragmenten durch Spiking-Experimente (das Zusetzen von bereits identifizierten Fragmenten und Beobachten von Peakflächenzunahmen) erschwert. Auch die Identifizierung über die abgeschätzte Proteinmasse durch Extrapolation ist nicht möglich. Denn unabhängig davon, ob die SDS-Protein-Trennung in der Kapillare oder im polymerisierten Gel stattfindet, ist die Massenbestimmung ungenau. Zusätzlich kann sich das Verhältnis von gebundenem SDS zu Protein, abhängig von der Sequenz und Struktur des Proteins, unterscheiden, wodurch die bestimmte Masse von der realen Masse noch stärker abweichen kann [3 - 4].

Die ungenaue Massenbestimmung erlaubt keine eindeutige Identifizierung der Verunreinigungen. Durch die Bestimmung einer genauen Masse dieser Fragmente mittels Massenspektrometrie (MS) wird die Identifikation hingegen ermöglicht. Leider ist eine direkte Kopplung von CE(SDS) nicht möglich, da sich im hochviskosen Trenngelpuffer Dextran befindet sowie nicht flüchtige Bestandteile wie Borat – vor allem aber auch das Tensid SDS, was zur kompletten Suppression des Proteins im Ionisierungsprozess führt [5]. Ein Upscaling dieser CE(SDS)-Methode für eine mögliche Fraktionssammlung mit einer anschließenden Offline-Probenvorbereitung bezüglich MS-Kompatibilität ist wegen der kleinen Volumina und des hochviskosen Trenngelpuffers nicht möglich.

Online-Massenspektrometrie durch zweidimensionale Kapillarelektrophorese

Unser Ansatz für eine Online-MS-Kopplung beruht darauf, eine zweite Trenndimension in Form einer Kapillarzonenelektrophorese (CZE) zwischen CE(SDS)-Trennung und MS zu schalten (Bild 1a) [6]. Diese ermöglicht, die MS-inkompatiblen Bestandteile vom Analyten abzutrennen. Um den für die vorausgegangene Trennung notwendigen und sehr stabilen SDS-Protein-Komplex zu lösen, ist eine zusätzliche Probenaufarbeitung erforderlich. Für diese Dekomplexierung des SDS-Protein-Komplexes wurde daher eine Online-Strategie in der zweiten Trenndimension entwickelt. Diese besteht aus der Co-Injektion eines organischen Lösemittels (hier Methanol) und eines kationischen Tensids (hier Cetylltrimethylammoniumbromid (CTAB)), das vor bzw. nach dem SDS- Protein-Komplex in der Kapillare der zweiten Trenndimension positioniert wird.

Analyse von Antikörperfragmenten mittels CE(SDS)-CZE-MS-System. Die CE(SDS)-UV Trennung von einem gestressten, intakten Antikörper und den dazugehörigen ladungsentfalteten Massenspektren von Peak 1 (blau) und Peak 2 (grün) die in der CZE-MS Dimension generiert wurden. © Springer

Die Kopplung der generischen CE(SDS)-Trennung in der ersten Trenndimension mit der CZE in der zweiten Trenndimension erfolgt über ein Nanoliter-Ventil mit vier Anschlüssen (Fa. VICI). Mit diesem Ventil ist es möglich, Hochspannung anzulegen (bis ca. 15 kV), die für die Trennung nötig ist. Eine interne Probenschleife im Nanoliterbereich (4, 10 oder 20 nl) ermöglicht es, diese sehr kleinen Volumina von einer Dimension in die andere zu überführen.

Die Trennung in der ersten CE(SDS)-Dimension wird mittels externer UV-Detektion verfolgt (Bild 1b). Damit kann während der Trennung berechnet werden, wann sich der zu charakterisierende Analytpeak in der Probenschleife des Ventils befindet und die Messung gestoppt werden muss. Gleichzeitig zur Analyse in der ersten Dimension werden das benötigte Methanol und das kationische Tensid CTAB für die Dekomplexierung in der zweiten Dimension hydrodynamisch injiziert und mit einem Leitfähigkeitsdetektor (C4D) positioniert. Sobald sich der Analytpeak in der Probenschleife und die Dekomplexierungslösungen in der zweiten Dimension an der richtigen Stelle befinden, wird das Ventil von Position A nach B geschaltet. Dadurch wird der SDS-Protein-Komplex zwischen der Methanol- und der CTAB-Zone positioniert (Bild 1c). Nachdem die Spannung in der zweiten Dimension angelegt wird, erfolgt die Dekomplexierung des Proteins. Dieses wandert vom SDS befreit und von den Störsubstanzen des Trenngelpuffers abgetrennt in einer neutral beschichteten Kapillare und einem essigsäurehaltigen Hintergrundelektrolyten in Richtung des Massenspektrometers (Bild 1d). Somit ist es möglich, ohne weitere Probenaufarbeitung online die genaue Masse eines Proteins zu bestimmen, das zuvor mittels generischer CE(SDS) getrennt wurde. Mit dieser genauen Masse ist es nun möglich, SDS-Protein-Peaks zu identifizieren. Dadurch werden Spiking-Experimente, die meist nicht sehr aussagekräftig sind, hinfällig.

Die Messung von Fragmenten eines intakten, thermisch gestressten Antikörpers mit dem zweidimensionalen Kapillarelektrophorese-System ist in Bild 2 dargestellt. Es war möglich, von beiden Peaks in der CE(SDS)-Dimension Massenspektren zu generieren. Es wurde ersichtlich, dass sich unter jedem CE(SDS)-Peak nicht nur ein, sondern mehrere Fragmente verbergen. Für Peak 1 (Bild 2, blau) konnte das Fragment 1C (23439,4 ± 1,5 Da) der leichten Kette des Antikörpers zugeordnet werden. Das Fragment 1B mit einer Massendifferenz von 103,7 Da zu der leichten Kette 1C könnte auf eine C-Terminale Abspaltung des Cysteins und 1A auf eine zusätzliche Wasserabspaltung zurückzuführen sein. Für den zweiten CE(SDS)-Peak (Bild 2, grün) ergaben sich ebenfalls drei Antikörperfragmente. Die Masse von Peak 2C von 47638,2 ± 0,7 Da wurde als Fab-Fragment identifiziert. Die Abspaltung der letzten zwei (T-H, ∆M = 238,2 Da) bzw. drei Aminosäuren (K-T-H, ∆M = 366,2 Da) mit einer Wasserabspaltung von diesem Fab-Fragment resultieren in den Massenpeaks 2B und 2A.

Fazit und Ausblick

Mit der hier vorgestellten Methode der zweidimensionalen Kapillarelektrophorese ist es möglich, Massenspektren von zuvor CE(SDS)-getrennten Proteinen online, ohne weitere Probenaufbereitung, zu erhalten. Mit den genauen Massen ist es möglich, die Identifikation von Verunreinigungen biopharmazeutischer Produkte zu erreichen und die Prozessoptimierung zur Herstellung entsprechender Medikamente zu unterstützen.

Adaptiert und übersetzt mit der Genehmigung von Springer, Analytical and Bioanalytical Chemistry, Online mass spectrometry of CE (SDS)-separated proteins by two-dimensional capillary electrophoresis, Römer et al., © (2019)

Literatur:
[1] Laemmli Nature 1970, 227, 680–685.
[2] Zhu et al. Anal Chim Acta. 2012, 709, 21–31.
[3] Guan et al. Sci Rep 2015, 5, 13370.
[4] Rath et al. Proc Natl Acad Sci USA 2009, 106(6), 1760–1765.
[5] Rundlett et al. Anal Chem 1996, 68(19), 3493-3497.
[6] Römer et al. Anal Bioanal Chem 2019, 411(27), 7197-7206.

AUTOREN

Jennifer Römer1
Cristina Montealegre1
Bernd Moritz2
Steffen Kiessig2
Christian Neusüß1
1 Hochschule Aalen, Fachbereich Chemie
F. Hoffmann-La-Roche Ltd, Basel, Schweiz

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