Bestimmung von Zuckeralkoholen und Mehrfachzuckern mit Lichtstreudetektor

Guter Zucker – schlechter Zucker

Fast jeder Mensch kann sich erinnern, als er als Kind zum ersten Mal ein Bonbon geschenkt bekam, an diesen süßen, fruchtigen und klebrigen Geschmack, der Lust auf mehr machte. Nicht zuletzt aus diesem Grund ist Zucker für die Lebensmittelindustrie ein gerne eingesetzter Rohstoff. Aber Zucker kann viel mehr als nur einen süßen Geschmack erzeugen - zum Beispiel diente er als Konservierungsmittel und er ist auch Energiespender (Glucose) für die Muskeln.

Die Gruppe der Saccharide umfasst die Bandbreite von Einfachzuckern (wie Glucose oder Fructose) bis hin zu Mehrfachzuckern, den Polysacchariden, sowie deren kleinere Einheiten, den Oligosacchariden, und erstreckt sich weiter zu Zuckeralkoholen, welche gerne als "gesünderer" Ersatz anstelle von Einfachzuckern eingesetzt werden.

Immer mehr Forschungsvorhaben entwickeln sich in der Pharmaindustrie, die sich mit der Bekämpfung von Krankheiten mit Oligosacchariden befassen. All diesen Molekülen ist jedoch eines gemeinsam: Sie können nur schwer mittels Standard-Detektionsverfahren analysiert werden. Ein bisher nur am Rande bekannter Detektor erlebt nun eine immer größer werdende Beliebtheit - der Lichtstreudetektor (ELSD).

Bestimmung von Zuckeralkoholen mit Lichtstreudetektor

Vielen ist die Glyx-Diät [1] ein Begriff, die von Marion Grillparzer 1999 eingeführt wurde. Sie beruht unter anderem darauf, überwiegend Lebensmittel mit niedrigem glykämischen Index (GI) zu sich zu nehmen. Produkte mit einem hohen GI werden schnell im Körper verdaut und als Fructose und Glucose ins Blut abgegeben. Dadurch steigt der Blutzuckerspiegel sehr rasch an, wodurch sofort viel Insulin ausgeschüttet wird, um diesen wieder zu senken. Als Folge fällt der Blutzuckerspiegel schnell wieder ab, was erneut zu einem Hungergefühl führt. Soweit die Theorie.

Ist der Blutzuckerspiegel durch Aufnahme von zu viel Zucker erhöht, geht der Anteil an Glucose, welcher nicht für den Energiebedarf benötigt wird, den Polyolweg, bei welchem die Glucose zunächst in Sorbitol und letztlich in Fructose umgewandelt wird. Daher werden Kohlenhydrate mit hohem glykämischen Index in Verbindung mit vielen Krankheitsbildern gebracht, wie Obesitas (Fettleibigkeit), Insulinresistenz, Bluthochdruck und Fettleber. Zusammengefasst werden diese Symptome als Metabolisches Syndrom bezeichnet.

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Biomarker für Diabetes Typ 2

Kürzlich erregte eine Studie eines Forscherteams der Universität Colorado Aufsehen, die in Nature Communications [2] veröffentlicht wurde. Sie zeigt, dass Mäuse, die 14 Wochen lang auf eine Diät mit 10 % Glucose gesetzt wurden, erhöhte Anzeichen des Metabolischen Syndroms zeigten. Bei der Kontrollgruppe, die Glucose nicht in Fructose umwandeln konnte, wurden keine Auffälligkeiten beobachtet. Daraus folgerten die Forscher, dass eine erhöhte Fructose-Bildung durch den Polyolweg und deren Metabolisierung in der Leber ein wichtiger Mechanismus bei der Ausbildung des Metabolischen Syndroms darstellt. Des Weiteren konnten Forscher des Unternehmens Pfizer [3] zeigen, dass Sorbitol, welches zunächst beim Polyolweg aus Glucose gebildet wird, ein Biomarker für Diabetes Typ 2 darstellt.

Aus diesen Forschungsergebnissen lässt sich rückschließen, dass Lebensmittel mit einem sehr hohen Anteil an Zucker, wie z.B. Softdrinks, die Ausbildung des Metabolischen Syndroms begünstigen können und Sorbitol ein geeigneter Biomarker zur Erkennung eines erhöhten Risikos ist. Ob Sorbitol selbst auch an der Entstehung des Metabolischen Syndroms beteiligt ist, konnte bisher nicht geklärt werden.

Sorbitol, ein Zuckeralkohol, wird neben anderen Zuckeralkoholen in vielen Lebensmitteln als Zucker-Ersatz zugegeben. Die Lebensmittelindustrie verwendet solche Stoffe gerne, da diese kalorienarmen Süßstoffe u.a. fast keine Zahnschäden verursachen. In wieweit die direkte Aufnahme des Sorbitols einen Einfluss auf die Verwendung als Biomarker hat, wird noch erforscht. Um diese Forschungen zu unterstützen, sind Analysenmethoden unabdingbar, mit denen Sorbitol und Glucose bestimmt werden können.

Analyse von Zuckeralkoholen

Zuckeralkohole haben, wie Zucker generell, keinen UV-Chromophor und werden daher normalerweise mit einem Brechungsindex-Detektor (RID) bestimmt. Dieser ist jedoch nicht für die Multikomponentenanalyse verwendbar. Eine Alternative stellt der Lichtstreudetektor (ELSD) dar, welcher hier für die Bestimmung von acht Zuckeralkoholen neben Glucose verwendet wird.

Das Prinzip eines ELSD besteht darin, den Eluenten mit einem Sprühkopf in feinste Tröpfchen zu vernebeln. Dieser Tröpfchennebel wird durch ein beheiztes Inlet zum Detektor geführt, während größere Tropfen schon vor dem Einlass abgefangen werden und nicht in den Detektor gelangen. Durch die Auswahl der Temperatur des Einlasses werden die Eluentenbestandteile der Tröpfchen weitestgehend verdampft, so dass nur noch Bestandteile der Analyten zum Detektor gelangen. Im Lichstreudetektor verändern die Analyt-Teilchen die Lichtstreuung eines blauen LED-Lichts, welche letztlich detektiert wird. Somit erzeugt jeder Analyt ein konzentrationsabhängiges Signal, denn je mehr Teilchen durch den Lichtstrahl gelangen, desto größer ist die Änderung der Lichtstreuung.

Tabelle 1 zeigt die analytischen Bedingungen, mit denen die Substanzen analysiert werden. Das Chromatogramm in Bild 1 zeigt die Auftrennung einer Standardmischung aus acht Zuckeralkoholen bei einer 10- μl-Injektion einer 250 mg/l konzentrierten Lösung.

Neben Sorbitol konnten die Süßstoffe Erythritol, Xylitol, Mannitol, Inositol, Maltitol, Lactitol und Palatinol bestimmt werden. Um diese Methode auf Realproben anwenden zu können, bedarf es unterschiedlicher Probenvorbereitungen, welche in Bild 2 dargestellt sind. Zunächst werden die Proben eines funktionellen Getränks, zuckerfreien Bonbons und einer zuckerfreien Minztablette gelöst, teilweise zentrifugiert und filtriert. Die erhaltenen Chromatogramme sind in den Bildern 3 bis 5 gezeigt. Während im funktionellen Getränk neben einem kleinen Anteil Glucose hauptsächlich Erythritol nachgewiesen wurde, zeigte das zuckerfreie Bonbon eine Mischung aus drei Süßstoffen, nämlich Xylitol, Sorbitol und Maltitol. In der zuckerfreien Minztablette ließ sich lediglich Sorbitol detektieren.

Somit ist bei der Analyse von Zuckeralkoholen, insbesondere Sorbitol, ein Lichtstreudetektor der Detektor der Wahl. Durch die simultane Detektion von Sorbitol und Glucose kann diese Methode neben der Analyse von Süßstoffen in Lebensmitteln auch für die Bestimmung von Sorbitol als Biomarker in Blutserum angewendet werden, was eine angepasste Probenaufarbeitung erfordert.

Zucker in der Pharmaindustrie

Zucker spielen jedoch nicht nur beim Metabolischen Syndrom eine wichtige Rolle. Saccharide kommen ubiquitär auf Zelloberflächen im Körper vor, wo sie z.B. die Interaktion von Zellen untereinander steuern. Eine große Bedeutung haben hierbei die Oligosaccharide, kleinere Ketten von  Polysacchariden. Ziel der Forschungen ist es, funktionelle Gruppen innerhalb komplexer Gylcokonjugate oder Polysaccharide zu entdecken, um diese dann gezielt synthetisch zu modifizieren und so in die Interaktion der Zellen einzugreifen.

Mittlerweile gibt es Forschungsprojekte im Bereich Entzündung, Onkologie, Neurodegenerative Erkrankungen (Alzheimer, Multiple Sklerose), Arthritis und Infektionen. Die Regulierung des Immunsystems spielt hierbei eine Schlüsselrolle, da Kohlenhydrat-basierte Moleküle, wie Glycoproteine, also Zucker-Protein-Strukturen, bei der Interaktion von Zellen eine zentrale Funktion einnehmen. Die wohl bekanntesten Medikamente, die aus solchen Forschungen hervorgegangen sind, sind Tamiflu (Grippe), Acarbose (Diabetes) und Heparin (Thrombose) [4].

Analyse von Oligosacchariden

Oligosaccharide können mittels Gradientenelution sehr effektiv getrennt werden und mit einem Lichtstreudetektor detektiert werden. In Tabelle 2 sind die analytischen Bedingungen für eine Normalphasen-Trennung dargestellt. Zwar wurde in diesem Fall aufgrund der einfacheren Verfügbarkeit eine Bierprobe gewählt, die Analysenmethode kann aber auch für andere Probenarten eingesetzt werden.

Das Chromatogramm in Bild 5 zeigt die Auftrennung von ca. 20 verschiedenen Formen von Oligosacchariden. Diese existieren verzweigt mit 1-6 Glycosid-Bindungen oder linear mit 1-4 Gylcosid-Bindungen, welche gemeinsam eluieren. Die Analyse zeigt die Elution von Monosacchariden, Disacchariden, Trisacchariden und Heptasacchariden, die nacheinander in Gruppen detektiert werden. In Bild 6 sind die Strukturformeln von vier Zuckern gezeigt, die bei der Analyse aus Bild 5 detektiert wurden. Somit ist der Einsatz eines Lichtstreudetektors als Detektor der Wahl bei der Untersuchung von Oligosacchariden erfolgreich gezeigt worden. Durch den einfachen Aufbau des ELSD ist dieser ein robuster Detektor, welcher einfach in ein HPLC-System eingebunden werden kann.

Fazit

Lichtstreudetektoren können bei der Analyse von Zuckeralkoholen, Oligo- und Polysacchariden eingesetzt werden. Diese Technologie lässt sich etwa ebenso für die Bestimmung von Sorbitol als Biomarker in Blutserum anwenden wie für die Detektion funktioneller Gruppen als Basis für Medikamentenentwicklung. ELSD-Detektoren sind als universelle Detektoren sehr effektiv einsetzbar und zeichnen sich besonders durch hohe Stabilität aus. Als kompakte und robuste Geräte können sie einfach in jede HPLC integriert werden.

Literatur/Referenzen
[1] http://www.die-glyx-diaet.de/
[2] Miguel A. Lanaspa, et al., Nature Communications 4, Article number: 2434 doi:10.1038/ncomms3434
[3] Gregory M. Preston and Roberto A. Calle, Biomarker Insights 2010:5 33-38
[4] GlycoMar Limited, Oligosaccharides in Drug Discovery, 2012

Autor:
Sascha Giegold
Shimadzu Deutschland GmbH
Albert-Hahn-Str. 6-10
47269 Duisburg,
E-Mail: info@shimadzu.de

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